SNT 1961.17-2013 出口食品過敏原成分檢測 第17部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測羽扇豆成分

出口食品過敏原成分檢測第17部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測羽扇豆成分I ——第11部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測麩——第16部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測芥——第18部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測蕎本部分為SN/T1961的第17部分。1SN/T1961.17的本部分規(guī)定了食品中過敏原羽扇豆成分的實(shí)時(shí)熒光PC本部分所規(guī)定方法的最低檢出限(LOD)為0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。2名稱序列(5'-3')目的基因內(nèi)參照5’端引物內(nèi)參照3'端引物內(nèi)參照探針AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCFAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAA真核生物18SrRNA基因羽扇豆3'端引物FAM-CCCCTCGTGTCAGGAGGCGC18S-26S核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)用10%鹽酸調(diào)pH至8.0,121℃,高壓滅菌20min,備用。5.4蛋白酶K:20mg/μL。5.1070%乙醇。6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.4冰箱：2℃~8℃,-20℃。37檢測步驟7.1.1稱取300mg已制備好的樣品于2mL離心管中，加入600pLCTAB緩沖液和40μL蛋白酶K,振蕩混勻，65℃30min,期間每隔10min振蕩混勻；7.1.2加入500μL酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為25:24:1;強(qiáng)烈振蕩，12000g離心7.1.3吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12000g離心10min;7.1.4棄去上清液，用預(yù)熱至65℃的TE緩沖液溶解DNA;7.1.6加入200μL三氯甲烷：異戊醇(24:1),強(qiáng)烈振蕩，12000g離心15min;7.1.7吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12000g離心10min;7.1.8棄去上清液，70%乙醇洗滌一次，12000g離心1min;7.2DNA濃度和純度的測定取適量DNA溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測260nm和280nm處的吸收值。DNA的濃度按照式(1)計(jì)算。c=A?6o×N×50式中：A?260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)濃度為10μg/mL～100μg/mL,Azoo/Azgo比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。7.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測7.3.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25μL,其中含：樣品DNA(10μg/mL～100pg/mL)2μL,羽扇豆引物(10pmol/L)各1pL,羽扇豆探針(5μmol/L)1pL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5pL,dNTP(10μmol/L)1pL,10×PCR緩沖液2.5μL,水16pL。也可采用商品化的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系，樣品DNA2μL,羽扇豆引物對各1pL,羽扇豆探針1μL,dNTP1μL,Taq酶0.5μL,水補(bǔ)足至總體積25μL。真核生物內(nèi)參照的反應(yīng)體系同上，僅以真核生物引物對和探針替換羽扇豆引物對和探針。7.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)50℃/2min,95℃/10min;40個(gè)循環(huán)為95℃/15s,60℃/1min。7.3.3實(shí)驗(yàn)對照49.1結(jié)果判定c)如35.0<Ct值<40.0,則重復(fù)一次。如再次擴(kuò)增后Ct值仍為<40.0,則判定被檢樣品陽性；5cctcacaagcagtgcgaccccgtgaatctgtttactcct