2020年血凝抑制實驗報告材料

血凝抑制實驗報告【篇一】血凝抑制實驗報告禽流感血凝和血凝抑制試驗可用于血清中抗體水平的監(jiān)測，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)等。該試驗是目前世界衛(wèi)生組織和國際動物健康組織進行全球流感監(jiān)測所普遍釆用的方法，而且因其具有經(jīng)濟、快速、可靠、操作簡便、能夠處理大量的樣品，并能在短時間內報告禽流感抗體水平等優(yōu)點，已經(jīng)成為當前基層獸醫(yī)實驗室禽流感疫病監(jiān)測和免疫抗體檢測中最為常用的方法。但因該試驗受人為操作影響較大，經(jīng)常因操作不規(guī)范、不嚴謹?shù)仍斐山Y果偏差大、重復性差等問題，現(xiàn)根據(jù)幾年來的工作經(jīng)驗對該試驗過程中應注意的事項做一探討。一、血凝試驗操作程序1、 取96孔9°V形酶標板，用微量移液器在第一至第五排的ri2孔每孔加25卩LPBS液。2、 吸取25卩L標準禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混勻。3、 從第1孔吸取25nL混勻后的抗原液加到第2孔中,混勻后吸取25卩L加入到第3孔中，依次進行倍比稀釋至第二排最后一孔即第24孔，最后棄去25卩L。第三排孔至第四排孔同上操作。4、 依次向第一至第五排孔的每孔中加入25卩L1%的雞紅細胞懸液。5、 將酶標板置于微量振蕩器上振蕩1秒，室溫（2-25°C）靜置3min觀察結果（如果環(huán)境溫度太高，可置4°C環(huán)境下）。6、結果判定將板作45°傾斜，觀察紅細胞是否呈淚滴狀流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀釋倍數(shù)為1個血凝單位（HAU）二、血凝抑制試驗操作程序1、 根據(jù)血凝試驗結果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）2、 取96孔V形酶標板，用移液器在第ri2孔各加入25卩LPBSo3、 在第1孔加入25UL被檢血清，充分混勻后移出25卩L加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第12孔，棄去25卩Lo4、 按以上步驟加入陽性血清和陰性血清（各做兩份），作對照孔。5、 在第P12孔各加入25UL4單位抗原，置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫2-25°C下靜置3mino6、 每孔加入25卩L1%的雞紅細胞懸液。置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫（2-25°C）靜置4min后觀察結果，若環(huán)境溫度過高，可于4°C條件下進行，紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。7、 結果判定只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2,陽性對照孔誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。將酶標板作45°傾斜，以完全抑制紅細胞凝集的稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。當被檢血清效價大于等于41og2,判為禽流感抗體陽性。三、試驗過程中的注意事項1樣品的保存及試驗前處理1釆集的血液樣品應及時分離血清，分裝至離心管中,標記清楚，離心后吸出血清，對應編號冷藏送檢，并禁止運輸過程中劇烈震動。2-般情況下，在5天內檢測的樣品可放置在4°C的冰箱中冷藏，否則低溫冷凍保存。3在檢測前血清樣品應充分混勻，混勻時釆用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產生氣泡及血清中蛋白變性。4對出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品，可釆用反復攪動幾下再離心的方法有助于緩解該狀態(tài)。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時間不夠造成的血清未完全析出狀態(tài)。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。5水禽等樣品為排除非特異性反應，還應相應進行滅能反應。具體操作方法56°C水浴鍋3min或加等量1%雞紅細胞，輕搖后靜置3分鐘，離心，收集上清液即可。2器材的選擇1酶標板的選擇建議使用96孔9°V型板進行試驗，通過反復試驗證明9°V型板相對于11°板及13°板來講，具有紅細胞沉降速度快，產生的凝集圖像清晰、結果容易判定等優(yōu)點。2移液槍的選擇及使用單道、多道可調微量移液槍應選擇合適的量程，以便精確度的提高。以便混加抗原影響試使用時應釆用一檔吸液二檔排液的方法。吸取液體時，槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時應加在板孔底部。倍比稀釋血清時，應每孔至少反復吹吸6次，合均勻，還應注意盡量避免產生泡沫引起混合不均。及紅細胞時應在板內液面上方加樣，以免交叉污染，驗結果。以便混加抗原影響試加樣、倍比稀釋時應高度集中注意力，以免漏加、重復加樣等。3試劑的保存及配置1禽流感血凝抑制試驗所用的抗原、陽性血清應嚴格按照說明書的要求進行保存和配置，試驗前應提前將其恢復至室內溫?？乖谋４鏈囟葹?2°C,反復凍融會降低抗原的滴度，應避免反復凍融。2PH2、.1mol/L的PBS液的制備。應盡量現(xiàn)用現(xiàn)配。每次使用前應測PH值，以免時間過長而導致PH值發(fā)生改變。由于PH試紙跨度范圍偏大，PH值不易準確介定，因此采用酸度計準確測量PH值，以提高試驗的精確度。全部試驗均釆用同一種稀釋液。31%紅細胞的制備。為避免有些雞只的紅細胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細胞懸液時應選擇采取2-3只SPF雞或未進行過任何免疫過的成年公雞血液。當然釆血的前提條件是要按十分之一釆血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。釆血完畢后分裝至2ml容量的圓底離心管中，因為通過2ml與5ml兩種容量離心管相比較，放入5ml尖底離心管中的話，離心后，離心管底部紅細胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達不到洗脫干凈的目的。經(jīng)2xx3r/min,5~1min,棄去上液和紅細胞上層的白細胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使紅細胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復幾次直至上清液清亮透明為止。在加紅細胞過程中還須不斷輕搖以確保紅細胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細胞。制備好的紅細胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。4抗原液的配制先做血凝試驗測定效價，以抗原與紅細胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應往前推算兩孔，即除以4后的值。每次做試驗前，必須重新檢測禽流感抗原的血凝效價，以免效價發(fā)生改變而導致抗原稀釋倍數(shù)不準確，從而導致試驗結果不準確。為保證配制的抗原準確，還要進行抗原回滴試驗。具體方法做二排抗原回滴，在兩排的第18孔各加25微升PBS,取4HAU抗原25微升加在兩排的第1、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，另一排同樣。從第2至第8孔補25微升PBS,以保持75微升總量不變，另一排同樣。兩排的第1至第8孔各加25微升1%紅細胞，震蕩1秒鐘。靜置3分鐘觀察結果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75微升總量，第5至第8孔為空白對照。如果抗原回滴試驗不成立，應相應調整抗原濃度直至回滴試驗成立。因為如果抗原濃度過高，則所測定的抗體效價水平偏低，如果抗原濃度過低，則所測定的效價偏高。所以不調整抗原濃度至實驗成立的話會對結果有很大影響。4結果的判定每次試驗必須設陽性及陰性（空白）對照血清，判別試驗是否成立。判讀結果時，將酶標板傾斜45°,以孔底沉淀的紅細胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒為凝集完全抑制。5試驗器具的清洗每次試驗完畢后，應將酶標板中液體甩凈，然后用自來水反復沖凈每個孔，再放入3%NaH中4小時，清水反復沖凈，再放入3%Hcl中4小時，清水反復沖凈，再用蒸偏水反復沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實驗用燒杯、加樣槽、量筒等也應充分洗凈、干燥。以免器具內有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗結果。四、小結在進行禽流感血凝抑制試驗時，應充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測結果才會真實可靠，準確掌握禽類的免疫抗體水平，進而為科學防控禽流感提供理論依據(jù)?！酒垦种茖嶒瀳蟾骐S著養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展和廣大養(yǎng)殖戶科學意識的不斷提高，人們普遍認識到實驗室檢測技術在臨床應用的重要性。下面簡單介紹一下雞新城疫微量血凝試驗和血凝抑制試驗的注意事項及操作方法。應用用于新城疫、產蛋下降綜合征和傳梁性支氣管炎等的母源抗體的檢測、雛雞首免日齡的確定、疫苗免疫后的免疫應答的監(jiān)測、臨床雞病的鑒別診斷等。注意事項一、 樣本要具有代表性所采樣本要能代表整體，通常釆用四角加中間的隨機取樣法，并且確定適當?shù)臉悠窋?shù)量，一般1只以下的雞群采樣率在2-5%；5只以下12%；5R以上.51%。對產蛋期間的雞群可采雞蛋；對雛雞或青年雞，可釆血。方法是取青霉素小瓶，洗凈后用蒸餡水沖洗、控干水分，并注意不要用消毒劑，以免影響結果。每只雞釆血量在1ml左右，不低于1ml,在室溫下靜置至血清自然析出。二、 四單位抗原的準確性要獲得準確的監(jiān)測效果，先做紅血球的凝集試驗，即測得抗原的血凝價，爾后前移2孔作為四單位抗原的稀釋度。三、 紅血球洗脫的充分性原則上，新城疫檢測所用的紅血球應來源于非疫苗免疫過的健康公雞，但實際上卻多釆用免疫過疫苗的健康公雞，有時甚至是病雞。因此，對紅血球的洗脫的次數(shù)要多、要充分，并注意轉速和時間，通常釆用五次變速離心法前四次為每分鐘15轉，每次5分鐘,最后一次為每分鐘3轉，持續(xù)78分鐘。另外，洗紅血球過程中，應注意動作要輕，玻璃儀器之間盡量減少碰撞，以免造成紅血球破裂而影響結果。四、 結果判定的及時性檢測中，每次試驗均應設抗原與生理鹽水對照，加入紅血球后，每隔5分鐘觀察一次，一旦兩列對照孔圖像清晰地顯示出來時，應立即對樣本進行結果判定，過早過晚都會影響判定結果的準確性。血凝與血凝抑制試驗的操作方法一、 材料與儀器新城疫抗原、1%雞紅血球、抗凝劑、生理鹽水、被檢血清、離心機、吸管、滴管、洗耳球、燒杯、量筒、注射器、長針頭、96孔V型醫(yī)用血凝板、微量移液器、微量振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱等。二、 方法1%雞紅血球的制備用長針刺入雞心臟或翅下靜脈，釆血，釆血量視用量而定，5%抗凝劑與全血的比例為134。洗血球共洗45次，每次58分鐘，紅血球與生理鹽水的比例至少為123。離心機轉速為每分鐘153轉，最后傾去上清。吸紅血球泥1ml加生理鹽水99ml,配成1%紅血球備用。三、 血凝試驗血凝板上12個孔內全部加入生理鹽水，每孔.5ml,吸等量新城疫抗原于第一孔內，混勻后吸出同量于第二孔內混勻，以此類推稀釋至第11孔，并棄去.5ml,留第12孔作為生理鹽水對照，然后全部孔內加入1%雞紅血球。將血凝板置于振蕩器上振蕩12分鐘，使材料充分混均，放入恒溫培養(yǎng)箱，每5分鐘觀察一次，至115分鐘取出，一般以生理鹽水對照孔的圖象清析地出現(xiàn)為準。結果判定紅血球在反應板底部全部均勻鋪開為完全凝集(++++),在血凝板底部集為一小紅點為沉淀(一)，如底部為一小紅點，四周為凝集的紅細胞，則為不完全凝集(++)出現(xiàn)完全凝集的抗原的稀釋度，即為該抗原的凝集價。四單位抗原的制備血凝試驗的結果如為28(256),則前移2孔即26(64)，作為四單位抗原的稀釋度。艮P63ml生理鹽水+lml抗原即為四單位抗原。四、 血凝抑制試驗血凝板上111孔全部加入.5ml的生理鹽水，于