GB∕T 35959-2018 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法通則

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法通則中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局GB/Z35959—2018 I 2規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法提要 2 36儀器配置 37儀器安裝環(huán)境要求、安全及注意事項 48分析步驟 59數(shù)據(jù)質(zhì)量的保證 9I本指導(dǎo)性技術(shù)文件按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本指導(dǎo)性技術(shù)文件由中國石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會提出。本指導(dǎo)性技術(shù)文件由全國化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC63)歸口。本指導(dǎo)性技術(shù)文件起草單位：廣東省茂名市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、中國檢驗認(rèn)證集團寧波有限公司、中國石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會、中海油天津化工研究設(shè)計院有限公司、重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心、華南師范大學(xué)、中國石油化工股份有限公司北京北化院燕山分院、杭州市特種設(shè)備檢測研究院。本指導(dǎo)性技術(shù)文件主要起草人：安曉春、馬宏園、陳會明、王振新、楊建海、吳曉濤、王琪、宋乃寧、本指導(dǎo)性技術(shù)文件僅供參考。有關(guān)本指導(dǎo)性技術(shù)文件的建議和意見，請向國務(wù)院標(biāo)準(zhǔn)化行政主管部門反映。1液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法通則本指導(dǎo)性技術(shù)文件規(guī)定了使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法進行定性定量分析的通用規(guī)則。本指導(dǎo)性技術(shù)文件適用于使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法對化合物定性定量分析的一般要求。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6041質(zhì)譜分析方法通則GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T16631—2008高效液相色譜法通則GB/T6041和GB/T16631界定的以及下列術(shù)語和定義適用干本文件。液相色譜法liquidchromatography;LC用液體作為流動相的色譜法。質(zhì)譜法massspectrometry試樣被電離后，形成不同質(zhì)荷比的離子，根據(jù)這些離子的質(zhì)量數(shù)和相對豐度分析試樣的方法。用作分離功能的液相色譜與具有定性定量功能的質(zhì)譜實現(xiàn)在線相聯(lián)的一種分析技術(shù)。m/x離子的質(zhì)量m與其所帶的電荷數(shù)x之比，以m/z表示。在一段連續(xù)的質(zhì)量范圍內(nèi)對所有質(zhì)量的離子進行檢測。對多對母離子及其相應(yīng)產(chǎn)生的子離子的過程進行監(jiān)測。提取離子色譜圖extractedionchromatogram;EIC在一張總離子流色譜圖上挑選某一個質(zhì)荷比離子，得到該離子的強度隨時間變化關(guān)系圖。2GB/Z35959—2018調(diào)諧tuning當(dāng)質(zhì)譜儀的高真空達(dá)到要求值并處于穩(wěn)定狀態(tài)后，檢查質(zhì)譜儀質(zhì)量坐標(biāo)的準(zhǔn)確性，通過自動或手動調(diào)節(jié)儀器的各項參數(shù)，使儀器達(dá)到最佳狀態(tài)。4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法提要液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀主要由液相色譜、接口裝置、質(zhì)譜儀、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。液相色譜能有效地將待測物的成分分離開，質(zhì)譜儀能對分開的成分逐個檢測，得到分子量、結(jié)構(gòu)和濃度信息。聯(lián)機的關(guān)鍵是適用接口的開發(fā)。常見的接口裝置是大氣壓電離源(API),其包括電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學(xué)離子源(APCI)和大氣壓光電離子源(APPI)等。API的特點列于表1。表1大氣壓電離源(API)類型原理應(yīng)用電噴霧離子源去除溶劑后的液滴電離成離子的過程適用于強極性化合物分析大氣壓化學(xué)離子源利用電暈放電使空氣中某些中性分子電離，溶劑分子也被電離，這些離子與樣品分子進行離子-分子反應(yīng)，使樣品分子離子化適用于中等極性化合物分析大氣壓光電離子源樣品經(jīng)加熱和霧化，使溶劑和溶質(zhì)氣化，用一定波長的光與它們作用，實現(xiàn)氣相離子反應(yīng)適用于弱極性及至非極性化合物分析液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是利用試樣各組分在色譜柱中的流動相和固定相間的分配和吸附系數(shù)不同，由流動相把試樣帶入色譜柱中進行分離后，經(jīng)接口裝置，由離子源離子化產(chǎn)生帶有一定電荷、質(zhì)量數(shù)的離子碎片，不同的離子碎片在不同的電場和(或)磁場的運動行為不同，質(zhì)量分析器(見表2)把離子按質(zhì)荷比分開，得到依質(zhì)量順序排列的質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析處理，可以得到樣品的定性、定量分析結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法將色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可應(yīng)用于測定大分子量、極性、熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的化合物。表2質(zhì)量分析器類型原理特點扇形磁質(zhì)量分析器樣品在離子源內(nèi)電離成離子，在加速電壓的作用下，以一定的速度進入均勻的磁場，受到與離子運動方向和磁場方向垂直的力，沿著曲率半徑為r的軌跡運動，離子經(jīng)質(zhì)量分析器，按質(zhì)荷比分離并聚焦單聚焦磁質(zhì)量分析器分辨率低，雙聚焦磁質(zhì)量分析器分辨率很高四極桿質(zhì)量分析器在特定的四極場中，某一質(zhì)荷比的離子能作穩(wěn)定的振蕩，通過四極場面被接收，其他質(zhì)荷比的離子則被濾掉，在保持直流電壓和射頻電壓振幅比值恒定而連續(xù)改變它們的值(掃描)時，不同質(zhì)荷比的離子依次通過四極場，實現(xiàn)質(zhì)量分離體積小，重量輕，操作方便，掃描速度快，靈敏度高3GB/Z35959—2018表2(續(xù))類型原理特點析器用一個脈沖將離子源中的離子瞬間引出，經(jīng)加速電壓加速，它們具有相同的動能進入漂移管，質(zhì)荷比小的離子具有最快的速度因而首先到達(dá)檢測器，質(zhì)荷比大的離子則最后到達(dá)檢測器檢測離子的質(zhì)荷比范圍非常寬；靈敏度高；掃描速度快離子阱質(zhì)量分析器離子阱與四極質(zhì)量分析器的原理類似，當(dāng)高頻電壓幅值和高頻電壓頻率固定為某一值時，只能使某一質(zhì)荷比的離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測器結(jié)構(gòu)簡單、價格便宜，性價比高；靈敏度高；質(zhì)量范圍大傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器將離子源產(chǎn)生的離子束引入ICR中，隨后施加一個涵蓋了所有離子回旋頻率的寬頻域射頻信號。在此信號的激發(fā)下，所有的離子都開始進行回旋運動?；匦\動在ICR的接受板上感應(yīng)出一個像電流，并且被精確地記錄下來。在經(jīng)過傅立葉頻轉(zhuǎn)換以后就可以獲得一個完整的頻率域譜具有高分辨率、高靈敏度、質(zhì)量范圍寬、掃描速度快、性能可靠；可以完成多級(時間上)串聯(lián)質(zhì)譜的操作5.1通用要求水、試劑和溶劑在分析前應(yīng)經(jīng)過有效過濾。5.2水本標(biāo)準(zhǔn)使用的水應(yīng)滿足GB/T6682中規(guī)定的一級水。5.3試劑試劑應(yīng)是分析純試劑或純度更高的試劑。試劑不應(yīng)干擾分析。溶劑應(yīng)是色譜級的產(chǎn)品或質(zhì)量相當(dāng)或純度更高的產(chǎn)品。它們不應(yīng)干擾所使用的檢測器性能。氣體應(yīng)是高純的惰性氣體，如氮氣、氬氣等，并符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。6儀器配置6.1進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)應(yīng)密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。自動進樣是常用的進樣方式。6.2液相色譜柱色譜柱是色譜系統(tǒng)的核心，對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快等。從進樣器到色譜4柱入口的流路和從色譜柱出口到質(zhì)譜的流路應(yīng)使用死體積盡可能小的管路。6.3離子源離子源是質(zhì)譜儀最重要的部分，常用的是大氣壓電離源(API),包括電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學(xué)離子源(APCI)和大氣壓光電離子源(APPI)等。其中ESI最常用。6.4質(zhì)量分析系統(tǒng)質(zhì)量分析系統(tǒng)能將不同質(zhì)荷比的離子進行分離。質(zhì)量分析系統(tǒng)有幾種不同的類型，包括扇形磁場、四極桿、離子阱、飛行時間以及傅立葉變換離子回旋共振等。6.5檢測器檢測器包括離子收集和信號放大與輸出等。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀能實現(xiàn)高靈敏度檢測的關(guān)鍵在于檢測器，檢測器的增益、動態(tài)范圍、響應(yīng)時間、噪聲值等是評價它的主要性能指標(biāo)。6.6入口系統(tǒng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的入口系統(tǒng)涉及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的接口。6.7真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)一般是由低真空的機械泵和高真空泵組合而成的真空機組。高真空泵可以是油擴散泵或者是分子渦輪泵，若是前者則需附上冷阱系統(tǒng)，以冷凝油蒸氣。質(zhì)譜儀需在真空條件下進行工作，產(chǎn)生的離子從質(zhì)量分離到收集器檢測的整個過程中不可與其他殘留氣體分子發(fā)生碰撞，否則會失去一部分能量使它的運動軌道發(fā)生偏離。6.8數(shù)據(jù)系統(tǒng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)也稱工作站，其包括硬件、軟件和接口，用作數(shù)據(jù)采集、存儲、處理、檢索和儀器自動控制。6.9儀器性能指標(biāo)6.9.1液相色譜的性能指標(biāo)液相色譜的性能指標(biāo)包括泵的最大工作壓力、壓力脈動、流量范圍、流量精密度、流量準(zhǔn)確度、梯度混合精密度、梯度混合準(zhǔn)確度、梯度延遲體積、自動進樣精密度、自動進樣量的樣品污染度。6.9.2質(zhì)譜的性能指標(biāo)質(zhì)譜的性能指標(biāo)包括分辨率、靈敏度、質(zhì)量范圍、質(zhì)量穩(wěn)定性、線性范圍、檢測限、質(zhì)量準(zhǔn)確性、峰面積(或峰高)重復(fù)性、離子豐度比重復(fù)性、保留時間重復(fù)性。7儀器安裝環(huán)境要求、安全及注意事項7.1儀器安裝環(huán)境要求：a)溫度應(yīng)在20℃~30℃,相對濕度應(yīng)小于70%;b)避免震動和陽光直射；c)工作環(huán)境應(yīng)清潔無塵、無腐蝕性氣體，避免高濃度有機溶劑蒸氣，有良好的通風(fēng)；d)避免強磁場和電場干擾。5a)液氮罐運輸時只能立放，不能躺放，為了防止翻倒，須用皮帶或其他物品固定，為了緩和沖擊，應(yīng)使用海綿或其他軟墊墊底；嚴(yán)防沖擊和碰撞；使用前檢查容器內(nèi)部是否清潔干燥；長期存放液氮的房間應(yīng)開窗通風(fēng)、換氣等；b)直接接觸儀器內(nèi)部有可能引起電擊，在檢查和維修時，應(yīng)先切斷電源；c)當(dāng)使用壓力容器內(nèi)氣體時，要遵從相關(guān)規(guī)定。如果其容器置于儀器附近，則應(yīng)將容器固定到基7.3注意事項：a)在操作儀器前，要檢查儀器管路、接頭等處是否漏液和漏氣；b)定期檢查真空泵泵油，定期檢查供氣系統(tǒng)(碰撞氣、霧化氣等)的壓力情況；c)儀器在待機和開機狀態(tài)下，應(yīng)保證足夠的氣源供應(yīng)。應(yīng)時常檢查液氮罐液位(或氮氣發(fā)生器的工作狀態(tài)),若供氣不足應(yīng)及時更換液氮罐(維修氮氣發(fā)生器);d)儀器室環(huán)境溫度應(yīng)控制低于儀器所要求范圍，室溫過高，會導(dǎo)致質(zhì)譜儀熱保護關(guān)機；e)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀接口避免進入不揮發(fā)的緩沖鹽溶液；f)電源電壓、容量和頻率應(yīng)滿足儀器要求且應(yīng)穩(wěn)定；g)儀器應(yīng)接地。8分析步驟8.1取樣及預(yù)處理操作按GB/T16631—2008中6.1規(guī)定。8.1.2預(yù)處理液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中有多種預(yù)處理方法，如：溶劑萃取、快速溶劑萃取、超臨界萃取、薄層色譜、柱色譜、固相萃取、固相微萃取、排阻色譜凈化、免疫親和萃取、分子印跡固相萃取、微波輔助萃取、化學(xué)衍生化、生物樣品預(yù)處理等，樣品溶液在進樣之前需要進過濾處理。如果有專項標(biāo)準(zhǔn)，則按該標(biāo)準(zhǔn)進行預(yù)處理；如果加入內(nèi)標(biāo)物，在色譜圖上內(nèi)標(biāo)物應(yīng)與樣品基質(zhì)分離良好，其保留時間應(yīng)與目標(biāo)組分的保留時間差別不大。預(yù)處理有可能引起來自試劑、容器、環(huán)境等的污染，引起雜質(zhì)的混入以及分析物的損失，應(yīng)引起注意。8.2液相色譜操作過程8.2.1色譜柱的選用色譜柱的型號規(guī)格各有不同，色譜柱的標(biāo)記除了柱填料的名稱外，還要指明色譜管的材料、長度和內(nèi)徑。用作色譜柱管的材料應(yīng)有足夠的強度、有光滑的內(nèi)表面、對洗脫劑和分析物惰性。根據(jù)分析品的類型、進樣量和特點及分析條件，色譜柱有不同的尺寸，按內(nèi)徑的不同可以將色譜柱分類如下：a)半制備柱：內(nèi)徑12mm～50mm(不含50mm);b)通用柱：內(nèi)徑3mm～12mm(不含12mm);c)半微柱：內(nèi)徑1mm～3mm(不含3mm);d)微柱：內(nèi)徑1mm以下。68.2.2液相色譜模式的確定和流動相配制按照目標(biāo)物質(zhì)的分析要求，應(yīng)確定液相色譜的模式是等度洗脫還是梯度洗脫。流動相都應(yīng)當(dāng)過濾和脫氣，在輸液系統(tǒng)的貯器內(nèi)存放的超純水最多不超過48h,最好一天內(nèi)更換。若含有有機溶劑的水相還可稍長。8.2.3液路系統(tǒng)脫氣更換流動相后，應(yīng)在液相色譜泵的排液口抽吸輸液系統(tǒng)內(nèi)的流動相，使后者充滿整個管路，達(dá)到脫氣的目的。分析目標(biāo)物質(zhì)首先應(yīng)考慮合適的色譜柱?？稍谝合嗌V泵運轉(zhuǎn)的情況下將管路與更換的色譜柱相接，以避免接頭處留存空氣。更換下來的色譜柱則需要合適的保存。8.2.5色譜柱的平衡色譜柱平衡的時間取決于柱長、流量及被分析物的性質(zhì)，以觀察保留時間的重復(fù)情況為準(zhǔn)。柱的平衡不僅局限于運行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的開始階段，當(dāng)從一個分析項目轉(zhuǎn)到另一個分析項目時也需要再次平衡，否則會影響結(jié)果的重現(xiàn)性。8.2.6色譜實驗條件的設(shè)置液相色譜的實驗條件包括：洗脫模式、流量、柱溫、自動進樣器的工作參數(shù)(包括吸液體積、吸液速度、進樣針吸液位置、洗針程序等)、流動相的配比、梯度洗脫程序、等度洗脫時間等。8.3質(zhì)譜儀操作過程當(dāng)質(zhì)譜儀的高真空達(dá)到要求值并處于穩(wěn)定狀態(tài)后，通過直接進樣口注射標(biāo)準(zhǔn)溶液對儀器進行調(diào)諧。利用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢查質(zhì)譜儀質(zhì)量坐標(biāo)的準(zhǔn)確性，通過自動或手動調(diào)節(jié)儀器的各項電參數(shù)和各氣體的流量。調(diào)諧可以理解為對儀器的校準(zhǔn)，表3為校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、配制及對應(yīng)校準(zhǔn)項目。表3校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、配制及對應(yīng)校準(zhǔn)項目標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或試劑溶劑濃度校正項目利血平溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)異丙醇：水=1:1(體積比)峰面積重復(fù)性、離子豐度比重復(fù)性和質(zhì)量準(zhǔn)確性利血平標(biāo)準(zhǔn)溶液A液相色譜流動相分辨率，信噪比和峰面積重復(fù)性利血平標(biāo)準(zhǔn)溶液B液相色譜流動相信噪比和峰面積重復(fù)性PPG425、PPG1000、PPG2000混合標(biāo)準(zhǔn)溶液含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸的甲醇水溶液甲醇：水=1:1(體積比)質(zhì)量準(zhǔn)確性咖啡因(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)質(zhì)量準(zhǔn)確性黃體酮(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)質(zhì)量準(zhǔn)確性7儀器在達(dá)到柱平衡后觀察基線在測定的質(zhì)量范圍內(nèi)是否有漂移，本底信號值有多大，以及有哪些雜質(zhì)峰等。在基線符合要求的前提下應(yīng)注意靠近目標(biāo)物質(zhì)保留時間處是否有明顯的干擾。使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進行優(yōu)化是常采用的方法，優(yōu)化過程中可以實現(xiàn)電參數(shù)和氣流流量的自動優(yōu)化。8.3.4質(zhì)譜實驗條件的設(shè)置質(zhì)譜實驗條件包括：離子化模式、正負(fù)離子選擇、分析模式、起始和結(jié)束的質(zhì)量數(shù)、掃描速度或每秒獲得的譜圖數(shù)、特征離子或離子對、駐留時間、質(zhì)譜峰的采樣頻率等。8.4數(shù)據(jù)處理和結(jié)果報告8.4.1數(shù)據(jù)處理8.4.1.1定性分析定性分析主要依賴于液相色譜的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，前者在相同的實驗條件下要求被分析物質(zhì)與標(biāo)樣之間保留時間的相對偏差允許為士2.5%以內(nèi)。對后者而言，通過數(shù)據(jù)的處理，如譜圖累加、本底扣除或譜圖相減，以便有效的進行二者比對。在相同條件下分析標(biāo)樣和樣品，得到譜圖，將稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液或混合稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留數(shù)據(jù)(保留時間、保留體積、調(diào)整保留體積、特征保留體積、相對保留值、保留系數(shù)等)與樣品中未知組分的保留數(shù)據(jù)進行比較，可進行定性分析。在這種情況下，為了確認(rèn)未知組分峰的單一性，可以改變分離條件進行測定，如改變流動相和固定相，也可使用其他定性技術(shù)來進行驗證。定性分析還可以通過一些數(shù)據(jù)進行定性，如：TIC或EIC色譜峰的保留時間，質(zhì)荷比m/z,化合物或離子的分子量、分子式、不飽和度，質(zhì)譜峰的同位素豐度比、結(jié)構(gòu)信息和氮規(guī)律以及多級質(zhì)譜等。數(shù)據(jù)處理的工作集中在基線的設(shè)定，峰檢出的參數(shù)調(diào)整，峰的平滑，重疊峰的界定。通過校準(zhǔn)曲線和面積積分獲得定量結(jié)果。此處使用校準(zhǔn)曲線而不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，在復(fù)雜基體存在時目標(biāo)物的定量測量應(yīng)當(dāng)是在相同或者相近基體存在的情況下建立相應(yīng)輸出量與標(biāo)樣量(或濃度)的關(guān)系曲線。樣品的測定可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法、內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法等方法進行測定。制備不少于5個梯度濃度的分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液(除空白樣),每個稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取一定體積進樣，記錄色譜圖，計算每個峰的面積。橫坐標(biāo)上取所進的稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物的量M