實驗一、培養(yǎng)基的配置與微生物的接種培養(yǎng)實驗

實驗一、培養(yǎng)基的配置與微生物的接種培養(yǎng)實驗

（-）實驗目的：通過實驗，使學生了解和掌握培養(yǎng)基的配置、消毒方法和接種與培

養(yǎng)技術。了解微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，不同微生物的生長差異。

（-）實驗原理：微生物必須在含有所需要的營養(yǎng)元素的培養(yǎng)基上才能生長，不同種類的微

生物有它所適宜生長的培養(yǎng)基，細菌和真菌的培養(yǎng)基不同，在長期的實踐中形成了有些著名

的培養(yǎng)基配方和配置方法。微生物的培養(yǎng)過程中要防止其他微生物的存在和生長，因此在接

種和培養(yǎng)過程中要進行滅菌和消毒，防止雜菌的干擾。滅菌方式中廣泛使用的是蒸汽滅菌，

即濕熱滅菌。是熱滅菌的好處是滅菌效果好，因蛋白質(zhì)在含水時易變性，另外蒸汽穿透力大,

含能量高。使用蒸汽滅菌器要注意排氣完全，否則達不到滅菌溫度。表1表示排空氣程度與

實際溫度的關系。

去1蒸汽滅菌其中空氣排除程度與器內(nèi)溫度的關系

空氣排除程度表壓力（kPa）滅菌器內(nèi)的實際溫度（℃）

完全排除98.07121

排除2/398.07115

排除1/398.07112

排除1/398.07109

完全未排除98.07100

蒸汽滅菌器的壓力有的以lb/ir?（磅/英寸2）、kg/cn?表示，現(xiàn)統(tǒng)一以帕（Pa）或千帕（kPa）

表示，它們與溫度的關系如表4-2。

表2蒸汽壓力與溫度的關系

蒸汽壓力相應溫度

kPaLb/in2Kg/cm2（℃）

34.4750.352107.7

68.95100.703115.5

103.42151.055121.6

137.90201.406126.6

172.37251.756130.5

206.84302.109134.4

表3糖在不同溫度下熱滅菌的破壞情況

分析方法糖名滅菌方法

（10%糖103.42kPa68.95?82.74kPa55.16~68.95kPa100℃

液）(121℃)(115.6?118C)(113~115.6℃)

15min20min20min30min

含破壞含量破壞含量破壞含破壞

量％%%%%%量％%

旋光法葡萄糖76.024.081.818.299.40.692.08.0

乳糖67.932.185.714.395.31.4.781.918.1

麥芽糖94.016.084.715.386.52.13.578.821.2

蔗糖87.712.397.72.398.7B1.396.33.7

表4一些微生物殺死的溫度與時間

微生物熱死時間微生物熱死時間

溫度時間溫度時間

℃minCmin

脆弱假單胞菌5035傷寒沙門氏菌605

氯針假單胞菌6010桑夫頓伯格沙門氏菌636*

熒光假單胞菌5325金黃色葡萄球菌607

賽氏桿菌（低溫性）3030大腸桿菌615~30

海產(chǎn)弧菌（低溫性）2580結(jié)核桿菌4730

鼠傷寒沙門氏菌5510*產(chǎn)氣腸細菌5060

*指活菌數(shù)減少一個對數(shù)級即90%被殺死所需的時間。

蒸汽滅菌適用范圍很廣，但主要是培養(yǎng)基的滅菌。在培養(yǎng)基滅菌中最需注意不要過多破

壞營養(yǎng)，特別是糖類。糖類在濕熱滅菌時破壞情況見表3。

（三）實驗材料

1.大腸桿菌、紅豆杉內(nèi)生真菌。

2.生化培養(yǎng)箱。

3.超靜工作臺

3.接種環(huán)或無菌牙簽。

4.酒精燈。

5.無菌培養(yǎng)皿。

6.肉湯培養(yǎng)基

牛肉膏0.5g水100ml

蛋白陳1.0gPH7.2

NaCl0.5g

加入1.2%瓊脂，即為固體完全培養(yǎng)基（CM）。

7.PDA培養(yǎng)基：PDA）：

馬鈴薯煮汁100毫升

蔗糖2克

瓊脂1.5克

PH值5.5?6.0

制法：先將新鮮無病害的馬鈴薯洗凈，去皮后切成小薄片，稱20克，加水

100毫升，煮沸20分鐘后過濾，其濾汁為馬鈴薯煮汁。然后加瓊脂和蔗糖煮溶,

后補足水分至100毫升，裝培養(yǎng)皿滅菌備用。

（四）操作步驟

1按上述要求配置2種培養(yǎng)基，分別裝入培養(yǎng)皿；

2放入高壓鍋中蒸汽滅菌20min。

3待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在兩種培養(yǎng)基上分別接種大腸桿菌和紅豆杉內(nèi)生真菌。37℃培養(yǎng)。

42天后檢查生長情況。

（五）實驗結(jié)果與討論

1.如何保證滅菌效果？

2不同種類的微生物菌落形態(tài)有何差異？

3如何為微生物選擇合適的培養(yǎng)基？

實驗二、微生物的顯微鏡觀察

（-）實驗目的：通過實驗使學生了解顯微鏡的結(jié)構和使用方法，了解和掌握微生物

的染色技術。

（-）實驗原理：

（三）實驗材料

1.菌種大腸桿菌，紅豆杉內(nèi)生真菌。

2.染色液草酸核結(jié)晶紫染液；蕃紅液。

3.器具顯微鏡，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，載玻片。

（四）操作步驟

1.將固定好的涂片加滴結(jié)晶紫Imin,若干了，還要補加染料。

2.用緩沖流水去染料。

3.加蕃紅液復染30s。

4.用緩沖流水沖去。

5.用洗水紙吸干，直接用顯微鏡觀察，先用低倍鏡觀察，然后用油浸鏡觀察，作圖。

（五）染色操作步驟及注意點

染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脫色、復染、水洗、干燥等步

驟，每一步都具有其操作要點和注意點，若不當心，可能就得不到滿意的結(jié)果。

1.制片制片要采用干凈的載波片，并注意接種環(huán)的無菌操作。做斜面菌體片時，要

防止菌體和水混和不均勻有團結(jié)現(xiàn)象，注意菌體量適中。

2.固定涂片后最好先在室溫下自然干燥，然后固定。固定的目的是：（1）殺死微生

物，固定其細胞結(jié)構；（2）保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，因而可以防止標本被沖洗掉;

（3）改變菌體對染料的通透性，一般使死細胞原生質(zhì)染色。

固定常用高溫。手執(zhí)載波片一側(cè)，標本面朝上，在火焰外層快速來回通過3?4次。共

約3?4s,要求玻面溫度不超過60℃,此時以手背皮膚接觸不覺過燙為度，放置待冷后染色。

由于熱固定改變細胞的內(nèi)部結(jié)構及外形，所以研究菌體細胞結(jié)構時常采用化學固定法。

常用的化學固定劑有：95%酒精、酒精和酸1：1的混和液、丙酮、1?2%鉞酸溶液。

適用于固定絲狀菌的固定液介紹兩種：（1）倍酸-醋酸-鉞酸液：倍酸1g,冰醋酸lg,1%鍬

酸1ml。（2）銘酸-醋酸-福爾馬林液：1%銘酸80ml,冰醋酸5ml,福爾馬林15ml。

鉞酸能很快固定細菌細胞而不改變其結(jié)構，因此用它來固定微生物細胞很方便。

3.媒染與染色標本固定以后，滴加染色液，使整個標本固定在染色液中。染色時間

視標本與染色的性質(zhì)而定，有時還需加熱。一般染色時間為1?3min。

如作復合染色，要在染色前作媒染處理。媒染劑與染料能形成不溶性的化合物，它能增

加染料和細胞的親和力（表3-2）。媒染一般在固定后進行，但也可結(jié)合固定或染色同時進

行。

5.水洗與干燥染色時間一到，就應用細小的緩流水將多余染料從標本上洗去，但不

會將細胞所吸附的染料洗去。洗凈后，將標本置桌上風干，也可用吸水紙輕輕吸去水分。有

時也可微微加熱，待干后再鏡檢。

6.標本玻片的封藏標本鏡檢后，有時需要長期保存，這是應將標本封存。常用的制

片粘著膠是加拿大膠，其制法是：混和等量的干加拿大膠和碳酸氫鈉在乳缽內(nèi)磨碎，加入等

量二甲苯，制成透明溶液，約一星期后過濾，并微熱，使溶液具適當稠度。保存在暗處，并

外涂黑色。將此液滴加到標本中，上蓋清潔蓋玻片，壓平，待干，保存。用此種中和性的加

拿大膠保藏標本，較不易褪色。

（六）實驗現(xiàn)象與分析

實驗3-蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳

一、實驗目的：掌握聚丙烯酰胺凝膠的配置，電泳儀的使用，蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電

泳分離的原理與方法。

二、原理

二、原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳按其電泳裝置和凝膠的形狀可分為垂直管型盤狀電泳和垂直板型

電泳。二者的操作原理和操作方式基本相同，不同的是前者在圓玻璃管內(nèi)將凝膠做成圓柱狀,

后者在兩塊平板玻璃之間將凝膠做成平板狀。

聚丙烯酰胺凝膠電泳按其凝膠的組成系統(tǒng)可分成四種：

（1）連續(xù)凝膠電泳：只用層凝膠，采用相同的pH值和相同的緩沖液。

（2）不連續(xù)凝膠電泳：采用二層或三層性質(zhì)不同的凝膠（即：樣品膠、濃縮膠和分離

膠）重疊起來，使用兩種不同的pH值和不同的緩沖液。

（3）梯度凝膠電泳：采用梯度混合裝置，使制得的凝膠由上至下孔徑逐漸減?。茨?/p>

膠濃度由上至下逐漸增高）。梯度凝膠電泳主要適宜于測定球蛋白的相對分子質(zhì)量。

（4）SDS-凝膠電泳:在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS（十二烷基硫酸鈉SodiumDdecyiSul-

fate）o

A.聚丙烯酰胺凝膠的制備原理

聚丙烯酰胺凝膠是用丙烯酰胺（Acrylamiae）和交聯(lián)劑N,N一甲叉雙丙烯酰胺（N,

N-methylenebisacrylamide,簡稱BIS）在催化劑的作用下聚合而成的。

所用的催化劑有兩種：①用過硫酸鏤和四甲基乙二胺（TEMED）作為化學聚合催化劑。

在TEMED或其他叔胺的催化下，由過硫酸鏤形成氧的自由基。氧的自山基又使丙烯酰胺形

成自由基，從而引發(fā)聚合作用。②用核黃素（vitb2）作為光聚合的催化劑。光聚合可用日光、

II光燈或電燈作為光源。在痕量的氧存在下，核黃素經(jīng)光解形成無色基，無色基再被氧氧化

形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。

在聚丙烯酰胺凝膠制備時，改變單體丙烯酰胺的濃度可使凝膠網(wǎng)狀結(jié)構中網(wǎng)眼的孔徑改

變。因此可根據(jù)被分離物質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小選擇適當?shù)臐舛?。交?lián)劑N,N-甲叉雙丙烯

酰胺的濃度對孔徑也有一些影響。當丙烯酰胺的總濃度不變時交聯(lián)劑的濃度占5%,則凝膠

孔徑最??；高于或低于5%,孔徑都相對變大。一般使用時交聯(lián)劑與單體濃度之比為2?5：

100o

B.不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理

不連續(xù)電泳使用二層或三層不同孔徑的凝膠，使用不同的pH和緩沖液，能使稀樣品在

電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。

不連續(xù)電泳的凝膠由上至下可分為：

（1）樣品膠：為大孔徑凝膠，在pH6.7?6.8的Tirs-HCl緩沖液中聚合而成，含有欲分

離的樣品。有時可不用這一層樣品膠，而直接將樣品液加入10%甘油或5%?20%蔗糖后，

加在濃縮膠的表面。

（2）濃縮膠：在pH6.7?6.8的Tris-HCl緩沖液中聚合而成的大孔徑凝膠。除了不含樣

品外，其他與樣品膠相同。樣品就是在濃縮膠中濃縮，按遷移率的不同，在濃縮膠與分離膠

的界面上壓縮成層的。

（3）分離膠：在pH8.8?8.9的Tirs-HCl緩沖液中聚合而成的小孔徑凝膠。樣品組分在

分離膠中進行電泳和分子篩分離。連續(xù)電泳時只用一層分離膠即可，其制備方法相同。

當不連續(xù)電泳的多層凝膠重疊在一起，用pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液置于電泳槽內(nèi)進

行電泳時，樣品就在濃縮膠中濃縮成狹窄的高濃度樣品層。這是因為在各層膠中都含有HC1,

HC1離解度大，幾乎全部成cr。C「在電場中泳動最快（遷移率最大），稱為快離子。而電泳

槽中含有甘氨酸，在樣品膠和濃縮膠中pH為6.7?6.8,甘氨酸只有0.1%?1.0%解離為CH?

（NH2）COO,在電場中遷移率最小，泳動速度最慢。而蛋白質(zhì)的泳動速度介乎快離子與

慢離子之間。它們的有效遷移率（有效遷移率為遷移率m與解離度a的乘積）按下列順序

排列：mcac>mPaP>mGaG（C為C「，P為蛋白質(zhì)，G為甘氨酸）。當電泳開始后，作為快離

子的C「很快超過蛋白質(zhì)，走在最前面，而使其后面形成一個離子濃度較低的低電導區(qū)。低

電導產(chǎn)生較高的電位梯度，這種高電位梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動，致使

蛋白質(zhì)在快、慢離子之間被濃縮成一狹窄的中間層。

當這一濃縮成層的樣品帶進入分離膠時，因分離膠的pH為9.5（配制分離膠時pH為

8.8?8.9,但在電泳過程中，根據(jù)測定結(jié)果pH實為9.5）,使甘氨酸的解離度增加，泳動速

度加快，很快地超過所有蛋白質(zhì)。高電位梯度消失，使蛋白質(zhì)在均?的電位梯度和pH的條

件下電泳分離。加上分離膠的孔徑較小，各蛋白質(zhì)因分子大小和形狀不同受分子篩效應使某

些凈電荷相同，而分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)也得以分離。

C.SDS-凝膠電泳原理：如前所述，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，其遷移率主要取

決于它所帶的電荷以及分予的大小和形狀。

但是，1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS（十二烷基硫酸

鈉），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量，而與它的形狀及所帶電荷無

關。在一定條件下蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與其電泳遷移率的關系，可用下式表示：

bm

Mw=K（10-）

LgMw=lgK-bm=C-bm

式中M”,-----相對分子質(zhì)量；

K,C——常數(shù)；

b——斜率；

m-----電泳遷移率。

因此，要則定某一蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量，只需比較核蛋白質(zhì)與其他已知相對分

子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在SDS-凝膠電泳上的遷移率即可。此法已廣泛地用于各種蛋白質(zhì)相對分子

質(zhì)量的測定，誤差不超過士10%。

為什么SDS-凝膠電泳會不受蛋白質(zhì)分子所帶電荷及分子形狀的影響呢？研究結(jié)果表明

在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和硫基乙醇后，硫基乙醇使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能

使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復合物。在一定

條件下，1.4gSDS與1g蛋白質(zhì)結(jié)合，由于SDS帶負電，使各種蛋白質(zhì)-SDS復合物帶上相

同密度的負電荷，而掩蓋了蛋白質(zhì)間原有電荷的差別。此外，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，引起

蛋白質(zhì)構象的變化，在水溶液中都變?yōu)殚L橢圓形，而且橢圓短軸長度均為18A左右，長軸

的長度則與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量成正比。為此，蛋白質(zhì)-SDS復合物在凝膠電泳中的遷移率,

不再受蛋白質(zhì)原有電荷和分子形狀的影響，而只決定于蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。

蛋白質(zhì)分子在pH高于其等電點的緩沖液液中帶負電，在電場中朝陽極移動。

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合而成，具有多

孔網(wǎng)狀結(jié)構。蛋白質(zhì)分子進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時，同時存在電荷效應和分子篩效應。帶

不同電荷或分子大小、形狀不同的蛋白質(zhì)分子，其移動速度不同，從而達到分離目的。蛋白

質(zhì)分子在pH高于其等電點的緩沖液中帶負電，在電場中朝陽極移動。

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合而成，具有多

孔網(wǎng)狀結(jié)構。蛋白質(zhì)分子進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時，同時存在電荷效應和分子篩效應。帶

不同電荷或分子大小、形狀不同的蛋白質(zhì)分子，其移動速度不同，從而達到分離目的。

丙烯酰胺凝膠電泳形式有垂直管型盤狀電泳和垂直板型電泳。兩者的原理和操作方法大

致相同。主要差別在于前者在玻璃管中制成圓柱形凝膠，后者在平行的玻璃板之間制成平板

狀凝膠。本實驗采用垂直管型盤狀電泳。

三、試劑和材料

(1)30%丙烯酰胺貯存液：稱取丙烯酰胺29.2g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加蒸儲水至

lOOmU裝于棕色瓶。于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)過硫酸筱溶液：配成10%濃度，當天配制使用。

(3)N,N,NN：四甲基乙二胺(TEMED)：避光保存。

(4)pH8.8?8.9,L5mol/LTris-HCl緩沖液:稱取18.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),

加241mlmol/L鹽酸，加水至100ml。

(5)pH6.7?6.80.5mol/Ltris-HCl緩沖液：稱取Tris6.0g,加48mlimol/L鹽酸，

加水至100ml。

(6)pH8.3,Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸饋水至1000mL

使用時加入等體積的水稀釋。

(7)指示染料：0.1%溟酚藍溶液。

(8)染色液：稱取三氯醋酸12.5g,加水至100ml,再加入0.1g考馬斯亮藍(Coomassie

blue)?

(9)脫色液：7%醋酸溶液；

(10)蛋白質(zhì)標準液；

(11)蛋白質(zhì)樣品液；

(12)電泳槽；

(13)直流穩(wěn)壓電源；

(14)微量注射器；

(15)注射器。

四、操作方法

1.分離膠的制備

將電泳制膠板洗凈干燥后，將開口端向上直立。備用。

按下列比例配制10%濃度的分離膠液：pH8.8,1.5mol/LTris-HCl緩沖液12ml,30%

丙烯酰胺貯存液16mL10%過硫酸鍍?nèi)芤?20Hl，加水20ml,混勻，真空抽出溶解的空氣。

然后加入TEMED100U1左右(溫度高，少加一些；室溫低，多加一些)，迅速混勻，用注

射器注入預先準備好電泳槽中，分離膠的高度約占玻璃槽面總高的三分之二。讓其聚合，控

制在30min左右聚合完畢。

2.濃縮膠的制備

分離膠聚合后，用濾紙條吸去膠面水液。濾紙不要碰膠面。

按下列比例配制5%濃度的濃縮膠膠液:pH6.8,0.5mol/LTris-HCl緩沖液4.5ml,30%

丙烯酰胺貯存液1.5ml,10%過硫酸筱451M，加水3ml,混勻，真空抽氣。然后加入和TEMED

(視室溫高低可稍加變動)，迅速混勻后，用注射器注入到分離膠上部，濃縮膠高度約0.5?

1cm,在膠面小心地加一層蒸儲水覆蓋，讓其聚合30min左右。

3.加樣

凝膠聚合好后，裝好電泳槽電泳槽，下槽加入pH8.3,Tris-甘氨酸電極緩沖液，液面要

超過電極線。

取一定體積的蛋白質(zhì)樣品液，與等體積的10%甘油溶液混合。每凝膠管加入樣品-甘油

混合液50U1（含蛋白質(zhì)5?100ug）。吸取一部分電極緩沖液，慢慢加到樣品液上面，至與

槽口平。然后于上槽中加進電極緩沖液，浸過凝膠管口。加幾滴指示染料于上槽電極緩沖液

中。

4.電泳

接好電極，負極在上槽，正極在下槽。接通電源。開始時用1?2mA/管的電流，電泳

5min左右。待染料層進入凝膠后，逐漸升高電流至4mA/管。維持電流穩(wěn)定，電泳至染料

達到凝膠下端為止關閉電源。取出凝膠管。

5.取出凝膠

將凝膠管浸在水中，用一長針頭注射器吸滿水，插入凝膠與槽壁之間。一邊轉(zhuǎn)動玻璃管，

一邊將針頭推進，同時注入水，將凝膠與槽壁分開，將凝膠取出。必要時I可用氣流將凝膠

壓出。

6.染色

將凝膠浸泡在染色液中，室溫下染色lOmin左右。染色液中的三氯醋酸同時使蛋白質(zhì)

固定在凝膠上。

7.脫色和保存

染色后的凝膠用水沖洗表面的染料，然后放在7%醋酸脫色液中，更換脫色液幾次，直

至無蛋白質(zhì)處的凝膠無色為止。必要時，可用熱的脫色液（80C左右），以加快脫色。也可

用電解脫色。

脫色后的凝膠，可放在7%醋酸中長期保存。

脫色用后的7%醋酸，可用活性炭吸附脫色，以重新使用。

（五）注意事項：凝膠不凝固常與pH值偏酸和催化劑用量有關，不要將電極裝反。

六、實驗結(jié)果與分析

實驗4纖微素酶活力測定

一、實驗目的：掌握酶活力測定原理與方法，加深溫度和pH值對酶活性影響效果的認

識。

二、原理：纖維素酶是水解纖維素生成纖維二糖及葡萄糖的?類酶的總稱。它包括c,酶，

Cx酶及纖維二糖酶（6-葡萄糖甘酶）。作用方式：天然纖維素（5酶）一直鏈纖維素（Cx酶）

一纖維二糖（纖維二糖酶）一葡萄糖。

其中5酶是使天然纖維素晶體都分鏈，起一個分離作用和水合作用，從而使天然纖維

素裂解成為直鏈纖維素。C、酶不能水解天然纖維素，而能水解直鏈纖維素的6-1,4-葡萄糖

甘酶鍵，生成纖維二酸，纖維二酶再經(jīng)過纖維二糖酶水解成為葡萄糖。

酶活力的測定原理是根據(jù)在達到反應平衡前單位時間內(nèi)底物的消失量或單位時間內(nèi)產(chǎn)物

的生成量。溫度和pH值顯著影響酶活性。

本法以濾紙和竣甲基纖維素鈉鹽（CMC）作為底物（基物），加入一定量的酶液，在一

定的條件下起作用，然后觀察濾紙的潰崩情況來判斷5前活力的大小。同時，測定CMC水

解液中還原糖的含量用來表示Cx酶活力的大小。

三、實驗材料

1.纖微素能

2.濾紙

3.濃硫酸

4.意酮

5.水浴鍋

6.722分光光度計

7.10%NaOH溶液

8.10%HC1（H2soD溶液

四、操作步驟

lo配置慈酮試劑：150mg慈酮溶于100ml70%稀硫酸中（76ml濃硫酸加到30ml水中），

測定時新鮮配置。在不同反應條件下與可溶性糖發(fā)生反應，可以測得提取物中糖的含量。

2.標準曲線的繪制

將配置好的10mg/ml葡萄糖標準溶液各取0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml溶于50ml容量

瓶中，加蒸儲水稀釋到刻度。分取上述配好的溶液1ml移入試管，加入4ml慈酮試劑，振

蕩，放入沸水浴加熱5分鐘，冷卻后在620nm下測定吸光度，所得吸光度Y與葡萄糖濃度

X的對應關系的回歸方程為

3.酶液的配置：稱0.25g纖微素前溶解于100ml容量瓶，使用時稀釋5倍。

4.酶解處理：稱取0.5g濾紙放于100ml燒杯中加50ml蒸儲水，加入l.ml酶液。分別設置

三組不同溫度室溫℃、45℃、60℃,三組不同pH值3、7、9。按不同時間取樣，與慈

酮進行反應。反應方法與標準葡萄糖溶液相同。

5.酶活力的計算

在試驗條件下，每1g纖微素酶在Imin內(nèi)，生成1Ug葡萄糖為一個酶活力單位。

五、注意事項：酶活力測定要在達到反應平衡前測初速度。

六、實驗結(jié)果與討論

制藥工程基礎實驗（化學藥物）

實驗一撲熱息痛的合成

-、目的要求

1、掌握撲息熱痛的合成和純化操作。

2、了解本品性質(zhì)、熟悉鑒別反應。

二、實驗原理

撲熱息痛為白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭，味微苦，易溶于熱水和乙醇，溶于丙酮,

微溶于冷水，飽和溶液呈弱酸性，在pH為6時穩(wěn)定，酸和堿可催化其水解。

三、實驗方法

在干燥的250ml圓底燒瓶中，加入對氨基苯酚25g,醋酎31g和冰醋酸44g。裝上回流

冷凝管，油浴加熱回流維持4小時后，改成蒸儲裝置，減壓蒸去醋酸，殘留

物傾入約等量的冰水中，攪拌結(jié)晶，抽濾，用冰水洗至中性，抽干，得到粗品。

粗品用一定的熱水溶解（約0.1g需1.5~2ml水，但產(chǎn)品不純，用水少得多，與原料質(zhì)

量有關），pH約為6,加適量活性碳脫色、過濾，濾液冷卻即有結(jié)晶析出，抽氣過濾，用少

量水洗，抽干，干燥，測熔點。

思考題：

1.試比較水楊酸和對氨基酚?；磻碾y易，為什么？

2.撲息熱痛的合成中是否可用乙酰氯代替醋酊，為什么？

實驗二阿司匹林（Aspirin）的合成

一、目的要求

1.掌握酯化反應和重結(jié)晶的原理及基本操作。

2.熟悉攪拌機的安裝及使用方法。

二、實驗原理

阿司匹林為解鎮(zhèn)痛藥，用于治療傷風、感冒、頭痛、發(fā)燒、神經(jīng)痛、關節(jié)痛及風濕病等。

近年來，又證明它具有抑制血小板凝聚的作用，其治療范圍又進一步擴大到預防血栓形成,

治療心血管疾患。阿司匹林化學名為2-乙酰氧基苯甲酸，化學結(jié)構式為：

rOCOCH：

COOH

阿司匹林為白色針狀或板狀結(jié)晶，mp」35~140℃,易溶乙醇，可溶于氯仿、乙醛，微

溶于水。

合成路線如下：

00OHOCOCH3

+C00H匕

CH3C-0-CCH3[T^r3COOH+CH3COOH

三、實驗方法

（-）酯化

在裝有攪拌棒及球形冷凝器的100mL三頸瓶中，依次加入水楊酸10g,醋酊14mL,

濃硫酸5滴。開動攪拌機，置油浴加熱，待浴溫升至70℃時，維持在此溫度反應30min。

停止攪拌，稍冷，將反應液傾入150mL冷水中，繼續(xù)攪拌，至阿司匹林全部析出。抽濾，

用少量稀乙醇洗滌，壓干，得粗品。

（二）精制

將所得粗品置于附有球形冷凝器的100mL圓底燒瓶中，加入30mL乙醇，于水浴上

加熱至阿司匹林全部溶解，稍冷，加入活性碳回流脫色10min,趁熱抽濾。將濾液慢慢傾

入75mL熱水中，自然冷卻至室溫，析出白色結(jié)晶。待結(jié)晶析出完全后，抽濾，用少量稀

乙醇洗滌，壓干，置紅外燈下干燥（干燥時溫度不超過60℃為宜），測熔點，計算收率.

（三）水楊酸限量檢查

取阿司匹林0.1g,加1mL乙醇溶解后，加冷水定適量，制成50mL溶液。立即加入

1mL新配制的稀硫酸鐵鏤溶液，搖勻；30秒內(nèi)顯色，與對于照液比較，不得更深（0.1%）。

對照液的制備：精密稱取水楊酸0」g,加少量水溶解后，加入1mL冰醋酸，搖勻；

加冷水定適量，制成1000mL溶液，搖勻。精密吸取1mL,加入1mL乙醇，48mL水，

及1mL新配制的稀硫酸鐵鍍?nèi)芤海瑩u勻。

稀硫酸鐵鐵溶液的制備：取鹽酸（Imol/L）1mL,硫酸鐵鏤指示液2mL,加冷水適

量，制成1000mL溶液，搖勻。

（四）結(jié)構確證

1.紅外吸收光譜法、標準物TLC對照法。

2.核磁共振光譜法。

思考題：

1.向反應液中加入少量濃硫酸的目的是什么？是否可以不加？為什么？

2.本反應可能發(fā)生那些副反應？產(chǎn)生哪些副產(chǎn)物？

3.阿司匹林精制選擇溶媒依據(jù)什么原理？為何濾液要自然冷卻？

實驗三撲炎痛（Benorylate）的合成

一、目的要求

1.通過乙酰水楊酰氯的制備，了解氯化試劑的選擇及操作中的注意事項。

2.通過本實驗了解拼合原理在化學結(jié)構修飾方面的應用。

3.通過本實驗了解Schotten-Baumann酯化反應原理。

二、實驗原理

東炎痛為一種新型解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，是由阿司匹林和撲熱息痛經(jīng)拼合原理制成，它既保

留了原藥的解熱鎮(zhèn)痛功能，又減小了原藥的毒副作用，并有協(xié)同作用。適用于急、慢性風濕

性關節(jié)炎，風濕痛，感冒發(fā)燒，頭痛及神經(jīng)痛等。撲炎痛化學名為2-乙酰氧基苯甲酸-乙酰

胺基苯酯，化學結(jié)構式為：

OCOC為

CCcoo-<JHNHCOCHJ

撲炎痛為白色結(jié)晶性粉末，無臭無味。mp」74~178℃,不溶于水，微溶于乙醇，溶于

氯仿、丙酮。

合成路線如下：

COOH