3-分子發(fā)光解析

第一節(jié)分子熒光和磷光

第二節(jié)分子熒光和磷光分析法

第三節(jié)分子發(fā)光分析Molecular

LuminescenceAnalysis,MLA第七章分子發(fā)光分析法第一節(jié)分子熒光與磷光一、分子熒光與磷光產(chǎn)生過程二、激發(fā)光譜與熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系

四、影響熒光強(qiáng)度的因素molecularfluorescenceandphosphorescence一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程

由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1.分子能級與躍遷

分子能級比原子能級復(fù)雜；在每個(gè)電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)各振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位（10-15s）

；

激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；

2.電子激發(fā)態(tài)的多重性（單重態(tài)、三重態(tài)）（1）電子激發(fā)態(tài)的多重性：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)，對應(yīng)；單重態(tài)能級和三重態(tài)能級。平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低。大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；（2）S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級圖)；進(jìn)入的幾率??；

3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)（去活化）時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫無輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光：10-7～10-9s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；磷光：10-4～100s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)；S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫非輻射能量傳遞過程

振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時(shí)間10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重性電子能級中,高能級（低振動能級）向低能級（高振動能級）間的無輻射能級交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射弛豫；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過程

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為

‘2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；

‘2>

2>

1；

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1

發(fā)光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜

熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.熒光光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線(圖中曲線II或III)。3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；假如,基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（

）：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；2.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。四、熒光強(qiáng)度及其影響因素1.熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If=

Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc

)If

=

I0(1-10-lc

)=

I0(1-e-2.3l

c

)

濃度很低時(shí)，

lc

小于0.05，將括號項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3

I0

lc=Kc

討論：熒光強(qiáng)度If：與

、

以及I0呈正比。；影響熒光強(qiáng)度的因素

影響熒光強(qiáng)度的外部因素2.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；3.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。4.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；5.溶液熒光的猝滅（1）碰撞猝滅；（2）重原子猝滅;

重原子的存在增加了自旋-軌道耦合作用，提高了系間竄躍幾率，通常導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，磷光強(qiáng)度增大。

（3）氧的熄滅作用：提高了系間竄躍幾率。（4）內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。第二節(jié)分子熒光與磷光分析法一、儀器與結(jié)構(gòu)流程二、熒光分析法和應(yīng)用三、磷光分析法的應(yīng)用一、儀器結(jié)構(gòu)流程

測量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測器通常成直角?；玖鞒倘鐖D：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管。磷光檢測熒光計(jì)上配上磷光測量附件即可對磷光進(jìn)行測量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測量磷光。測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源（斬波）和可控檢測技術(shù)（鎖相放大）。室溫測量時(shí)，不需要杜瓦瓶。二、熒光分析方法與應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）靈敏度高

比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級；為什么？檢測下限：0.1～0.1g/cm-3

相對靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。2.定量方法定量依據(jù)：

If

=2.3

I0

lc=Kc標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；3.熒光分析法的應(yīng)用(1)無機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)生物與有機(jī)化合物的分析見表三、磷光分析法的應(yīng)用1.稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；見表2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析

煙堿、降煙堿、新煙堿，2，4-D等分析檢測限0.01g/cm-3

3.藥物分析和臨床分析

見表第三節(jié)化學(xué)發(fā)光分析法一、基本原理二、化學(xué)發(fā)光分析的特點(diǎn)三裝置與技術(shù)一、基本原理1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h

（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)

E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt

分析物參加反應(yīng)的速率；3.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學(xué)反應(yīng)：

dc/dt=Kc；

K為反應(yīng)速率常數(shù)。定量依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測物濃度成線性：4.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型（1）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)-色譜檢測器

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h

最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h

發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：c.乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng/cm-3

～1g/cm-3；（2）火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；a.一氧化氮

NO+H→HNO*HNO

*→HNO+h

發(fā)射光譜范圍：660～770nm；

最大發(fā)射波長：690nm；

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O該反應(yīng)十分迅速；b.硫化物-色譜檢測器

揮發(fā)性硫化物SO2

、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（藍(lán)色）：

SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h

發(fā)射光譜范圍：350～460nm；

最大發(fā)射波長：394nm；

靈敏度：0.2ng/cm-3；

發(fā)射光強(qiáng)度與硫化物濃度的平方成正比。（3）液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測痕量的H2O2

、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.15～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。5.化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用（1）該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+

、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可檢測低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測定某些生物試樣

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O

葡萄糖酸+H2O2通過測定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶二、化學(xué)發(fā)光分析特點(diǎn)1.靈敏度極高

例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學(xué)發(fā)光分析，可測定210-17。Mol/L的ATP，即可檢測出一個(gè)細(xì)菌中的ATP含量2.儀器設(shè)備簡單不需要光源、單色器和背景校正；3.發(fā)射光強(qiáng)度測量無干擾無背景光、散射光等干擾；4.線性范圍寬5.分析速度快缺點(diǎn)：可供發(fā)光用的試劑少；發(fā)光反應(yīng)效率低（大大低于生物體中的發(fā)光）；機(jī)理研究少。三、裝置與技術(shù)裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測器信號放大器顯示與記錄

發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動注射的方式進(jìn)行：

靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合，測最大光強(qiáng)度或總發(fā)光量；試樣量小，重復(fù)性差；

流動注射方式：用蠕動泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定光強(qiáng)度；試樣量大；1.下列哪種去激發(fā)過程是分子熒光發(fā)射過程？

A．分子從第一激發(fā)單重態(tài)的各振動能級躍遷回基態(tài)；

B．分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級躍遷回基態(tài)；

C．分子從第一激發(fā)三重態(tài)的各振動能級躍遷回基態(tài)；

D．分子從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級躍遷回基態(tài)；2.下列說法中，正確的是哪一個(gè)？

A．能發(fā)熒光的物質(zhì)一般具有雜環(huán)化合物的剛性結(jié)構(gòu)；

B．能發(fā)熒光的物質(zhì)一般具有大環(huán)化合物的剛性結(jié)構(gòu)；

C．能發(fā)熒光的物質(zhì)一般具有對稱性質(zhì)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；

D．能發(fā)熒光的物質(zhì)一般具有π－π共軛體系的剛性結(jié)構(gòu)；3.在下列的四種說法中，哪一種是不正確的？

A．分子熒光發(fā)射光譜通常與吸收光譜互為鏡像關(guān)系；

B．分子熒光發(fā)射光譜與激發(fā)波長沒有關(guān)系；

C．分子熒光發(fā)射光譜隨激發(fā)波長不同而變化；

D．分子熒光發(fā)射的強(qiáng)度與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比的關(guān)系。4.在分子熒光測量中，要使熒光強(qiáng)度正比于熒光物質(zhì)的濃度，必要的條件是什么？

A.用高靈敏的檢測器；B.在最大的量子產(chǎn)率下測量；

C.在最大的摩爾吸光系數(shù)下測量；D.在稀溶液中測量。5.分子熒光的發(fā)射波長λem比激發(fā)波長λex大或者??？為什么？

A．大；因?yàn)槿ゼぐl(fā)過程中存在各種形式的無輻射躍遷，損失一部分能量；

B．??；因?yàn)榧ぐl(fā)過程中，分子吸收一部分外界能量；

C．相同；因?yàn)榧ぐl(fā)和發(fā)射在同樣的能級上躍遷，只是過程相反；

D．不一定；因?yàn)槠洳ㄩL的大小受到測量條件的影響。6.同一熒光(磷光)物質(zhì)的最大激發(fā)波長λe