YY-T 1939-2024 醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)方法 重組C因子法

0 0ICS11.40.10 0CCSC30中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T

1939—2024醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)方法重組C因子法t i c c tTesforbactert i c c t-

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-國家藥品監(jiān)督管理局 發(fā)

布YY/T1939—2024前 言本文件按照

GB/T1.標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由國家藥品監(jiān)督管理局提出。S本文件由全國醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(AC/TC248)歸口。S本文件起草單位:山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院、中國食品藥品檢定研究院、遼寧省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測院。本文件主要起草人:孫令驍、邵安良、余洋、秦越、王小蕾、王詩琪。YY/T1939—2024引 言細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要成分,通常由多糖

O

型抗原、核心低聚糖和類脂

A

組成,其中類脂

A是內(nèi)毒素的生物活性中心。從臨床角度看,內(nèi)毒素引起的膿毒癥、膿毒性休克和多器官衰竭是死亡率較高的全身性疾病。在自然界中,革蘭氏陰性菌廣泛分布于水(江河和海洋)、空氣、土壤和人體中,醫(yī)療器械制造過程中的高壓蒸汽滅菌、輻照和氣體滅菌能夠殺滅細(xì)菌,但不能滅活內(nèi)毒素。由于細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中,性質(zhì)穩(wěn)定并且可以穿透常規(guī)的除菌濾膜,因此很難預(yù)防細(xì)菌內(nèi)毒素污染。目前凝膠法和光度測定法是醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)最主要的試驗(yàn)方法之一,該方法具有較高的靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)性,但該方法需要使用大量的鱟血來生產(chǎn)鱟試劑,而東方鱟已成為我國的二級保護(hù)動(dòng)物,因此繼續(xù)推廣使用凝膠法和光度測定法不利于鱟資源的保護(hù)和發(fā)展。重組C因子法是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的一種補(bǔ)充方法,該方法的推廣使用,可保護(hù)生態(tài)環(huán)境、減緩鱟資源枯竭速度,且本法不存在

G因子旁路干擾,具有較高的專屬性。YY/T1939—2024醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)方法重組C因子法1

范圍本文件描述了利用重組C因子法檢測醫(yī)療器械中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的試驗(yàn)方法。本文件適用于對醫(yī)療器械進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測。2

規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3

術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。13.1C因子

factorC鱟試劑中一種對細(xì)菌內(nèi)毒素敏感,且能選擇性識別內(nèi)毒素的蛋白。23.2重組C因子

recombinantfactorC(1)鱟試劑中的C因子

3.

通過基因重組技術(shù)在真核細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋(1)4

試驗(yàn)原理重組C因子法是利用重組C因子試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的熒光信號變化而測定內(nèi)毒素含量的方法,重組C因子與細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)合后被激活,由無活性的蛋白酶原轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白酶,識別并催化下游熒光底物產(chǎn)生熒光信號,熒光信號的強(qiáng)度和內(nèi)毒素濃度成比例。分別測量重組C因子試劑和供試品溶液孵育前后的熒光值并校正,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。5

主要設(shè)備熒光酶標(biāo)儀或多功能酶標(biāo)儀、電熱干燥箱、旋渦混合器等。6

試劑和材料細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(以下簡稱“內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品”)、重組

C因子試劑盒、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、移液器、吸頭、微孔板。注1:重組C因子試劑盒中一般包括重組C因子酶溶液、熒光底物、緩沖液等試劑。2注2:試驗(yàn)所用耐熱器具常用干熱滅菌法,用電熱干燥箱(50℃、至少30min)去除可能存在的外源性內(nèi)毒素;塑料2器具如微孔板、與移液器配套的吸頭等,選用標(biāo)明無熱原或內(nèi)毒素含量<0.05EU/mL的器具。1

λ ………

λ …………(1)7

供試品溶液的制備以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為浸提介質(zhì),根據(jù)醫(yī)療器械的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定浸提介質(zhì)最大體積。按1照公式()計(jì)算浸提介質(zhì)最大體積。1V=

L式中:EV

———浸提介質(zhì)最大體積,單位為毫升每件(mL/件);EL

———產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限值,U/件;E3λ

———標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度(不應(yīng)低于所用重組C因子試劑的標(biāo)示檢測限),U/mL。E3浸提條件一般選擇(7±1)℃浸提不少于1h,視供試品具體性狀,按照如下合適的方法進(jìn)行供試品溶液的制備。a)

采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡供試品內(nèi)腔的方法制備供試品溶液。若存在內(nèi)腔不易浸泡等情況,宜將供試品剪碎或拆散處理,保證細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分接觸供試品內(nèi)部。b)

將供試品與患者直接或間接接觸部分置于無熱原玻璃器皿內(nèi),必要時(shí)可將供試品剪碎或拆散處理,加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水振搖數(shù)次。供試品溶液貯存不應(yīng)超過2h。對于結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜的供試品,宜對其拆解后分別進(jìn)行浸提,收集浸提液,即得供試品溶液。對于液體類產(chǎn)品,宜直接將液體作為供試品溶液。部分供試品溶液制備方法見相應(yīng)的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn),如

GB18671、YY/T1282等。必要時(shí),可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)供試品溶液(或其稀釋液)的pH,所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應(yīng)不含內(nèi)毒素和干擾因子。8

試驗(yàn)步驟18. 儀器增益調(diào)節(jié)1熒光酶標(biāo)儀的熒光信號被轉(zhuǎn)換為電子信號,可使用增益設(shè)置或靈敏度設(shè)置對該電子信號進(jìn)行“調(diào)諧”。當(dāng)檢測到的信號過弱時(shí),調(diào)高儀器的增益/靈敏度設(shè)置,或當(dāng)信號過強(qiáng)時(shí),則調(diào)低儀器的增益/靈敏度設(shè)置。553重組C因子試劑批次改變時(shí),進(jìn)行儀器增益調(diào)節(jié)。相對熒光單位(RFU,一種表示熒光信號強(qiáng)弱的553單位)的對數(shù)與增益的對數(shù)相關(guān)。因此,可通過分析0.EU/mL的重復(fù)測量值來確定最佳增益。使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.EU/mL的溶液,加入微孔板中,至少3個(gè)平行孔,于(7±1)℃的溫度下預(yù)孵育至少5min后取出,每個(gè)孔加入說明書規(guī)定比例的重組

C因子試劑,設(shè)置好激發(fā)/發(fā)射波長后進(jìn)行孵育,在時(shí)間點(diǎn)零時(shí)和反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)對每孔使用幾種不同增益值進(jìn)行檢測。用反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)的RFU減去在時(shí)間點(diǎn)零時(shí)的RFU得到ΔRFU值,計(jì)算平行孔的平均ΔRFU

值,根據(jù)ΔRFU值選擇最佳增益值。55 ,52示例:熒光酶標(biāo)儀的

RFU

范

圍

一

般

為

0~99999,0.

EU/mL

內(nèi)

毒

素

標(biāo)

準(zhǔn)

品

推

薦

的

RFU

范

圍55 ,5210000,1000~10000的

RFU范圍對應(yīng)的對數(shù)范圍是3~4,對數(shù)中點(diǎn)是3.。因此

0.EU/mL對應(yīng)的

ΔRFU

大約為3500,選擇

ΔRFU數(shù)值接近3500的增益值即為最佳增益值。8. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)218.. 當(dāng)使用新批號的重組C因子試劑或重組C因子法試驗(yàn)條件有任何可能會影響檢驗(yàn)結(jié)果的改21時(shí),應(yīng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解,在旋渦混合器上混勻2編號內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行孔數(shù)a溶液

A無供試品溶液至少2b溶液B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)(或附近點(diǎn))的濃度(設(shè)為λm)供試品溶液至少2c溶液C至少3個(gè)濃度(最低一點(diǎn)設(shè)定為λ)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水每一濃度至少2d溶液

D無細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水至少2a

浸提介質(zhì)體積不超過公式(1)中浸提介質(zhì)最大體積的供試品溶液。b

加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度的,且與溶液

A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。c

用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不應(yīng)大于10),最高濃度和最低濃度應(yīng)在重組

C因子試劑的檢測限內(nèi)。d

陰性對照。YY/T1939—202415min或參照標(biāo)準(zhǔn)品說明書中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作,制成至少3個(gè)濃度的稀釋液(相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不應(yīng)大于10),最低濃度不應(yīng)低于所用重組

C因子試劑的標(biāo)示檢測限。每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s或參照標(biāo)準(zhǔn)品說明書中要求的混勻時(shí)間進(jìn)行操作,每一濃度至少做3個(gè)平行孔。使用內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照(細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.05EU/mL的滅菌注射用水),陰性對照應(yīng)設(shè)置不少于2個(gè)平行孔。223 9r38.. 按照重組C因子試劑說明書的要求向微孔板中相應(yīng)的孔內(nèi)加入一定體積的陰性對照和內(nèi)223 9r3標(biāo)準(zhǔn)品,于(7±1)℃的溫度下預(yù)孵育至少5min,取出微孔板,按說明書要求將試劑盒中各試劑按比例混合,每個(gè)孔加入一定體積的重組C因子試劑,設(shè)置好激發(fā)/發(fā)射波長,讀取時(shí)間零點(diǎn)的熒光值后進(jìn)行孵育,孵育完成后再次讀數(shù)。當(dāng)陰性對照的RFU小于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)時(shí),可將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。如選擇線性回歸分析結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)()的絕對值應(yīng)大于或等于0.80,試驗(yàn)方為有效。否則重新試驗(yàn)。8. 干擾試驗(yàn)為了確定供試品溶液是否會干擾內(nèi)毒素和重組C因子的反應(yīng),進(jìn)行新產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行干擾試驗(yàn)。選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度(設(shè)為λm),作為供試品干擾試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度。按表1制備溶液

A、溶液B、溶液C和溶液D。表1

干擾試驗(yàn)溶液的配制22將試驗(yàn)溶液加入微孔板內(nèi),按照8..的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn),按所得線性回歸方程分別計(jì)算出溶表1

干擾試驗(yàn)溶液的配制22將試驗(yàn)溶液加入微孔板內(nèi),按照8..的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn),按所得線性回歸方程分別計(jì)算出溶液2R /CR=(

s-Ct)λm

×100% …………(2 /C式中:R

———回收率;EECs

———溶液B的內(nèi)毒素含量,U/mL;EECt

———溶液

A的內(nèi)毒素含量,U/mL;Eλm

———溶液B中加入的標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)(或附近點(diǎn))的內(nèi)毒素濃度,U/mL。E當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%~200%之間,則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在上述指定的范圍內(nèi),若供試品溶液在小于最大浸提體積的情況下對試驗(yàn)有干擾,應(yīng)對供試品進(jìn)行不超過最大浸提體積的進(jìn)一步稀釋,除此之外還可通過其他適宜的方法(如過濾、3YY/T1939—2024中和、透析或加熱處理等)排除干擾后再重復(fù)干擾試驗(yàn),應(yīng)確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性。當(dāng)重組C因子試劑、產(chǎn)品的配方、結(jié)構(gòu)組成、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí),重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。48. 檢查法43按照8.的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn),獲得供試品溶液反應(yīng)終點(diǎn)和時(shí)間零點(diǎn)的RFU值。39

結(jié)果計(jì)算和評價(jià)19. 結(jié)果計(jì)算1反應(yīng)終點(diǎn)和時(shí)間零點(diǎn)的

RFU

的差值為

ΔRFU,計(jì)算平行孔的平均

ΔRFU,并用陰性對照進(jìn)行校3正,按照公式()計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素濃度。3YXlg(

)=A

×lg(

)+B …………(3YX式中:Y

———ΔRFU;A———直線斜率;EX———細(xì)菌內(nèi)毒素濃度,U/mL;EB———直線截距。注:公式由建立標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。29. 結(jié)果評價(jià)與解釋2219.. 試驗(yàn)應(yīng)符合以下三個(gè)條件方為有效21 9ra)

系列溶液C的結(jié)果應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)()的絕對值大于或等于0.80的要 9rb)

用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后,計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率在50%~200%的范圍內(nèi);c)

陰性對照溶液D的RFU小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的RFU。229.. 若供試品溶液所有平行孔的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后,小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值,判