3.2基因工程的基本操作程序第一課時課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章第2節(jié)基因工程的基本操作程序從社會中來

1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左)與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(右)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取導(dǎo)入抗蟲基因

重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲?。ㄇ疤幔?.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵）4.目的基因的檢測與鑒定（保證）(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）抗蟲基因已插入染色體DNA中定義：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。目的基因受體細(xì)胞抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因1.目的基因一、目的基因的篩選與獲取根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。

獲取目的基因時獲取的是哪一部分的DNA片段？在解決這個問題之前，我們得先了解基因的結(jié)構(gòu)是怎樣的？【補充】基因的結(jié)構(gòu)DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段能編碼特定的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)。不轉(zhuǎn)錄、不翻譯不轉(zhuǎn)錄、不翻譯原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)：含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列，如啟動子、終止子RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動子終止子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因上游；本質(zhì)：位置：作用：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因下游；終止轉(zhuǎn)錄獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)典型的真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)間隔的、不連續(xù)的連續(xù)的、不間隔的編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄出mRNA原核細(xì)胞：真核細(xì)胞：間隔的、不連續(xù)的數(shù)量關(guān)系：外顯子=內(nèi)含子+1外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列根據(jù)受體細(xì)胞情況選擇是否包含內(nèi)含子【思考】真核細(xì)胞基因編碼區(qū)中的內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，但表達(dá)時是否轉(zhuǎn)錄？

轉(zhuǎn)錄初級RNA成熟mRNA非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子12345啟動子終止子剪切、拼接不完全相同原因：基因的選擇性表達(dá)。【問題探究1】同一個體不同體細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)錄的起點是否相同

（選“相同/不相同/不完全相同”）？

為什么？【補充】基因的結(jié)構(gòu)抗蟲基因有很多，那么如何篩選出合適的目的基因呢？二、篩選合適的目的基因1.較為有效的方法之一從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能。DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對序列數(shù)據(jù)庫測序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)序列比對工具(如BLAST)測定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內(nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。3.實例：Bt

抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因Bt抗蟲蛋白基因表達(dá)的Bt抗蟲蛋白抗蟲的原理是什么？是否對人畜有害當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響（1）從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蚪M文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（cDNA文庫）（包含一種生物的一部分基因）三、目的基因獲取方法1基因文庫概念2基因文庫類型3基因組文庫的構(gòu)建基因組DNA限制酶切基因組文庫mRNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,酶切cDNA文庫拼接質(zhì)粒，導(dǎo)入細(xì)菌中保存為文庫2.人工合成：DNA合成儀（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因在我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家采用的是人工合成的方法。3.利用PCR獲取和擴增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。（1）概念：PCR是________________的縮寫，它是一項根據(jù)________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應(yīng)條件，對_____________________進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制參與DNA復(fù)制目的基因的核苷酸序列（2）PCR反應(yīng)的組分和條件？DNA復(fù)制的過程細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的時候，解旋是靠_解旋酶完成的，合成DNA子鏈時要用到DNA聚合酶。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能3'端從端延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制需要引物，其作用是給DNA聚合酶提供3'端。3′5′DNA聚合酶3′5′模板鏈DNA聚合酶不能直接將單個的核苷酸聚合成鏈，因此子鏈合成需要引物。（最初的已有鏈）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′-端，子鏈的延伸方向是5′→3′(3).復(fù)制所需的基本條件:體內(nèi)DNA復(fù)制所需條件在DNA復(fù)制中的作用體外PCR所需條件CR

提供DNA復(fù)制的模板斷開氫鍵，打開DNA雙鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸體外用耐高溫的DNA聚合酶，如Taq酶體外用高溫代替4種脫氧核苷酸DNA聚合酶01

解旋酶DNA母鏈含目的基因DNA母鏈合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈

引物(RNA)（2種）一定的緩沖溶液(Mg2＋)維持反應(yīng)體系PH穩(wěn)定，DNA聚合酶需要Mg2＋激活細(xì)胞內(nèi)環(huán)境引物（通常為小的單鏈DNA）P77相關(guān)信息4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物PCR儀器:四種脫氧核苷酸(dNTP)穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。引物：決定PCR特異性擴增的關(guān)鍵①引物的長度通常為20-30bp。②引物自身不能含互補序列，否則會形成二級發(fā)卡結(jié)構(gòu)；兩個引物在3'端也不應(yīng)出現(xiàn)同源性，避免形成引物二聚體。③引物濃度不宜過高，否則會錯配。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。已知目的基因兩端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根據(jù)該序列合成引物。

1）變性（不需要解旋酶）：當(dāng)溫度上升到_______以上時，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴增的DNA片段第一步：變性3’3’5’5’3’5’3’5’變性90℃思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個溫度范圍，而不是95℃？因為變性的溫度與氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時，所需溫度也就越低。PCR反應(yīng)的過程2）復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過

堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。

第二步：復(fù)性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’5’5’思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因為Taq酶不能從0開始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。3’3’PCR反應(yīng)的過程復(fù)性的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？復(fù)性時引物與DNA模板的結(jié)合是隨機的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機會，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞機會。3）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。

第三步：延伸引物1引物2酶酶3’5’3’5’脫氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考：DNA聚合酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？結(jié)合在引物的3’端PCR反應(yīng)的過程PCR反應(yīng)過程耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸待擴增的DNA片段5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。PCR反應(yīng)過程引物第一次擴增擴增次數(shù)DNADNA數(shù)類型第1次第2次第3次第4次第n次DNA總數(shù)長鏈-中長鏈DNA中長鏈-短鏈DNA短鏈-短鏈DNA含引物A（或B）的DNA212223242n2222222000137154682（n-1）2n-2n2n-1PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較（1）PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)

（

）（2）PCR擴增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚

（

）（3）PCR過程使用的DNA聚合酶的特點是耐高溫

（

）（4）PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高

（

）判斷?？颊Z句，澄清易混易錯01拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation1.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在D