3.2基因工程的基本操作程序第一課時(shí)課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章第2節(jié)基因工程的基本操作程序從社會(huì)中來(lái)

1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左)與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(右)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過(guò)程蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無(wú)抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取導(dǎo)入抗蟲基因

重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲?。ㄇ疤幔?.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵）4.目的基因的檢測(cè)與鑒定（保證）(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）抗蟲基因已插入染色體DNA中定義：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。目的基因受體細(xì)胞抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因1.目的基因一、目的基因的篩選與獲取根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。

獲取目的基因時(shí)獲取的是哪一部分的DNA片段？在解決這個(gè)問(wèn)題之前，我們得先了解基因的結(jié)構(gòu)是怎樣的？【補(bǔ)充】基因的結(jié)構(gòu)DNA片段基因1基因2基因3放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段能編碼特定的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄出mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)。不轉(zhuǎn)錄、不翻譯不轉(zhuǎn)錄、不翻譯原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)：含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列，如啟動(dòng)子、終止子RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子終止子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因上游；本質(zhì)：位置：作用：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因下游；終止轉(zhuǎn)錄獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)典型的真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)間隔的、不連續(xù)的連續(xù)的、不間隔的編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄出mRNA原核細(xì)胞：真核細(xì)胞：間隔的、不連續(xù)的數(shù)量關(guān)系：外顯子=內(nèi)含子+1外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列根據(jù)受體細(xì)胞情況選擇是否包含內(nèi)含子【思考】真核細(xì)胞基因編碼區(qū)中的內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，但表達(dá)時(shí)是否轉(zhuǎn)錄？

轉(zhuǎn)錄初級(jí)RNA成熟mRNA非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345啟動(dòng)子終止子剪切、拼接不完全相同原因：基因的選擇性表達(dá)?！締?wèn)題探究1】同一個(gè)體不同體細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)是否相同

（選“相同/不相同/不完全相同”）？

為什么？【補(bǔ)充】基因的結(jié)構(gòu)抗蟲基因有很多，那么如何篩選出合適的目的基因呢？二、篩選合適的目的基因1.較為有效的方法之一從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。DNA測(cè)序儀核苷酸序列比對(duì)氨基酸序列比對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如GenBank)序列比對(duì)工具(如BLAST)測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的工具。通過(guò)比對(duì)識(shí)別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。3.實(shí)例：Bt

抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過(guò)程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因Bt抗蟲蛋白基因表達(dá)的Bt抗蟲蛋白抗蟲的原理是什么？是否對(duì)人畜有害當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)部分基因文庫(kù)（包含一種生物的所有基因）（cDNA文庫(kù)）（包含一種生物的一部分基因）三、目的基因獲取方法1基因文庫(kù)概念2基因文庫(kù)類型3基因組文庫(kù)的構(gòu)建基因組DNA限制酶切基因組文庫(kù)mRNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,酶切cDNA文庫(kù)拼接質(zhì)粒，導(dǎo)入細(xì)菌中保存為文庫(kù)2.人工合成：DNA合成儀（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因在我國(guó)首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過(guò)程中，科學(xué)家采用的是人工合成的方法。3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。（1）概念：PCR是________________的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)_____________________進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制參與DNA復(fù)制目的基因的核苷酸序列（2）PCR反應(yīng)的組分和條件？DNA復(fù)制的過(guò)程細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的時(shí)候，解旋是靠_解旋酶完成的，合成DNA子鏈時(shí)要用到DNA聚合酶。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能3'端從端延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制需要引物，其作用是給DNA聚合酶提供3'端。3′5′DNA聚合酶3′5′模板鏈DNA聚合酶不能直接將單個(gè)的核苷酸聚合成鏈，因此子鏈合成需要引物。（最初的已有鏈）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端，子鏈的延伸方向是5′→3′(3).復(fù)制所需的基本條件:體內(nèi)DNA復(fù)制所需條件在DNA復(fù)制中的作用體外PCR所需條件CR

提供DNA復(fù)制的模板斷開(kāi)氫鍵，打開(kāi)DNA雙鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸體外用耐高溫的DNA聚合酶，如Taq酶體外用高溫代替4種脫氧核苷酸DNA聚合酶01

解旋酶DNA母鏈含目的基因DNA母鏈合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈

引物(RNA)（2種）一定的緩沖溶液(Mg2＋)維持反應(yīng)體系PH穩(wěn)定，DNA聚合酶需要Mg2＋激活細(xì)胞內(nèi)環(huán)境引物（通常為小的單鏈DNA）P77相關(guān)信息4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物PCR儀器:四種脫氧核苷酸(dNTP)穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。引物：決定PCR特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵①引物的長(zhǎng)度通常為20-30bp。②引物自身不能含互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)；兩個(gè)引物在3'端也不應(yīng)出現(xiàn)同源性，避免形成引物二聚體。③引物濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)錯(cuò)配。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。已知目的基因兩端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根據(jù)該序列合成引物。

1）變性（不需要解旋酶）：當(dāng)溫度上升到_______以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段第一步：變性3’3’5’5’3’5’3’5’變性90℃思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。PCR反應(yīng)的過(guò)程2）復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)

堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。

第二步：復(fù)性引物1引物2DNA引物3’5’3’5’5’5’思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從0開(kāi)始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。3’3’PCR反應(yīng)的過(guò)程復(fù)性的過(guò)程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開(kāi)的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是：①模板鏈一般比較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。3）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時(shí)，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

第三步：延伸引物1引物2酶酶3’5’3’5’脫氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考：DNA聚合酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？結(jié)合在引物的3’端PCR反應(yīng)的過(guò)程PCR反應(yīng)過(guò)程耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸待擴(kuò)增的DNA片段5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。PCR反應(yīng)過(guò)程引物第一次擴(kuò)增擴(kuò)增次數(shù)DNADNA數(shù)類型第1次第2次第3次第4次第n次DNA總數(shù)長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA短鏈-短鏈DNA含引物A（或B）的DNA212223242n2222222000137154682（n-1）2n-2n2n-1PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較（1）PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)

（

）（2）PCR擴(kuò)增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚

（

）（3）PCR過(guò)程使用的DNA聚合酶的特點(diǎn)是耐高溫

（

）（4）PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高

（

）判斷?？颊Z(yǔ)句，澄清易混易錯(cuò)01拓展應(yīng)用——PCR相關(guān)計(jì)算Theirapplication——PCRcorrelationcalculation1.“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在D