高中生物同步備課系列【備教案】3.2.2 基因工程的基本操作程序 -人教2019版選擇性必修3

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序（第2課時）教案一、教學(xué)目標(biāo)1.闡明基因工程的原理和基本操作程序。（生命觀念）2.掌握目的基因的篩選與獲取方法，簡述PCR的原理、條件及過程。（生命觀念、科學(xué)思維）3.學(xué)會基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法和要求，簡述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過程。（科學(xué)探究）4.理解目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的具體過程，闡明將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。（科學(xué)探究）5.掌握并闡明目的基因檢測與鑒定的方法。（科學(xué)探究、社會責(zé)任）6.掌握DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的方法。（科學(xué)探究）二、教學(xué)重難點【教學(xué)重點】1.簡述PCR的原理、條件及過程。2.簡述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過程。3.闡明將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。4.闡明目的基因的檢測與鑒定的方法。5.闡明基因工程的原理和基本操作程序?！窘虒W(xué)難點】1.簡述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過程。2.闡明基因工程的原理和基本操作程序。三、教學(xué)過程【新課導(dǎo)入】情境導(dǎo)入：回顧基因工程的基本操作程序討論：1.構(gòu)建好的Bt基因表達(dá)載體通過什么方式導(dǎo)入棉花細(xì)胞？提示：在獲得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的過程中，受體細(xì)胞有植物、動物、微生物之分，受體細(xì)胞不同，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不完全相同。2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些，分別適用于什么生物？進(jìn)而引出本節(jié)學(xué)習(xí)內(nèi)容——基因表達(dá)載體的構(gòu)建第三步和第四步，即將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定【新課講授】（一）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建好的基因表達(dá)載體需要通過一定的方式才能進(jìn)入受體細(xì)胞。那么，通過什么方法能讓構(gòu)建好的基因表達(dá)載體進(jìn)入到受體細(xì)胞呢？提示：轉(zhuǎn)化。引導(dǎo)學(xué)生歸納概括轉(zhuǎn)化的概念。轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是將目的基因整合到受體細(xì)胞基因組中。教師：組織學(xué)生閱讀教材P80-81頁的文字內(nèi)容和資料卡，闡明將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法，理解目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的具體過程，并進(jìn)行歸納總結(jié)。學(xué)生：閱讀教材，思考討論，歸納總結(jié)。教師：進(jìn)行評價和補(bǔ)充。展示將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）花粉管通道法（受體細(xì)胞：受精卵）這是我國科學(xué)家獨創(chuàng)的一種方法，是一種十分簡便、經(jīng)濟(jì)的方法，我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的。操作方法：①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。（2）基因槍法單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。將目的基因吸附在微小的金?；蜴u粒表面，然后將微粒用基因槍高速射入受體細(xì)胞或組織。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌的特點：農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且將其整合到該受體細(xì)胞染色體DNA上。②轉(zhuǎn)化原理：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞時，Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。③轉(zhuǎn)化過程展示農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖：第一次拼接：將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。第二次拼接：(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。第一次導(dǎo)入：將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。第二次導(dǎo)入：(非人工操作)含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。④具體轉(zhuǎn)化方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株。受體細(xì)胞為體細(xì)胞。b.可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受體細(xì)胞為受精卵。2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞——顯微注射法（1）常用方法：顯微注射技術(shù)（2）受體細(xì)胞：受精卵。因為受精卵容易表現(xiàn)出全能性。①個體大，易操作。②受精卵全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。（3）基本操作程序：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純→利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→獲得具有新性狀的動物。3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。受體細(xì)胞：常用原核生物作為受體細(xì)胞。（1）原核生物的特點：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少等。早期的基因工程操作都用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛。（2）操作過程：Ca2+處理大腸桿菌（Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性）→使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞）→將重組的基因表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合導(dǎo)入其中→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。注意說明：①將基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2+處理法。Ca2+（或CaCl2溶液）對微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。②目的基因能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并表達(dá)的關(guān)鍵是目的基因是否插入到受體細(xì)胞染色體DNA上（原理是基因重組）。③不同種類的受體細(xì)胞：對于植物來說，受體細(xì)胞可以是受精卵和體細(xì)胞；對于動物來說，受體細(xì)胞一般是受精卵，受精卵具有體積大、易操作、經(jīng)培養(yǎng)可直接表達(dá)性狀的優(yōu)點。小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（二）目的基因的檢測與鑒定問題：基因表達(dá)載體中已經(jīng)具備標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因），對受體細(xì)胞進(jìn)行了篩選，為什么基因工程的第四步還要對目的基因進(jìn)行檢測和鑒定？提示：在含抗生素的選擇培養(yǎng)基上能生長的是導(dǎo)入了載體的細(xì)胞，這里的載體可能是基因表達(dá)載體，也可能是未插入目的基因的空載體。因此第四步需要對目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。此外，即便在選擇培養(yǎng)基上能生長的細(xì)胞中導(dǎo)入的是基因表達(dá)載體，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正確，能否正確表達(dá)，因此也需要在轉(zhuǎn)錄和翻譯以及個體水平上進(jìn)行檢測和鑒定。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這也是檢查抗蟲棉是否培育成功的一步。教師：組織學(xué)生閱讀P82頁，從分子水平和個體生物學(xué)水平分析目的基因的檢測與鑒定，掌握并闡明目的基因檢測與鑒定的方法。學(xué)生：自主學(xué)習(xí)，歸納、總結(jié)。1.分子水平的檢測（1）檢測目的基因是否導(dǎo)入——通過PCR等技術(shù)檢測如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄——通過PCR等技術(shù)檢測如：檢測Bt基因是否翻譯出mRNA（3）檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測2.個體生物學(xué)水平的檢測其次，還需要進(jìn)行個體生物學(xué)水平的鑒定。例如，通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度?？偨Y(jié)基因工程的基本操作程序探究·實踐·DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實驗原理（1）利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：①利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增。②PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。③PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。（2）DNA片段電泳鑒定的原理：①DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。②PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）等有關(guān)。③凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。2.材料用具（1）儀器PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）微量離心管（實際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）（2）用具4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等3.方法步驟（1）DNA片段的擴(kuò)增①移液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。PCR反應(yīng)體系的配方如下圖所示：②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）③反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min//30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。（2）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液：根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。②制備凝膠：將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。③加樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物④電泳：接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。⑤觀察記錄：取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。注意說明：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。播放實驗視頻《DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定》，讓學(xué)生了解實驗過程，并在觀看實驗視頻的過程中，思考結(jié)果分析與評價中的問題。4.結(jié)果分析與評價小組討論，問題探討：1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？提示：可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。提示：如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取Ｈ绻麛U(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等?！镜缴鐣腥ァ啃〗M討論，聯(lián)系社會熱點問題，完成相關(guān)探究：1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？提示：科研人員對長江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？提示：科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動子、提高殺蟲基因的表達(dá)量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因（如CrylAa和CrylAc基因）同時轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補(bǔ)作用擴(kuò)大抗蟲范圍。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學(xué)殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場需設(shè)計專門的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度（如將轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作），這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生了抗性，但是因為其與敏感目標(biāo)害蟲交配，后代抗性基因會發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生產(chǎn)評價等?！菊n后總結(jié)】思維導(dǎo)圖【課堂作業(yè)】1.下列屬于PCR技術(shù)所需條件的是（B） ①單鏈的核苷酸序列引物②目的基因所在的DNA片段③脫氧核苷酸④核糖核苷酸⑤DNA連接酶⑥D(zhuǎn)NA聚合酶⑦限制酶A.①②③⑤ B.①②③⑥C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦2.質(zhì)粒上的抗性基因在基因工程中的主要作用是（C）A.使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)易于表達(dá)B.使受體細(xì)胞具有抗藥性C.有利于對目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行檢測D.促進(jìn)目的基因與導(dǎo)入的外源基因相連接，提高轉(zhuǎn)基因操作的成功率3.科學(xué)家已能運(yùn)用基因工程技術(shù)，讓羊合成并由乳腺分泌抗體，相關(guān)敘述中正確的是（B）①該技術(shù)將導(dǎo)致定向變異；②DNA連接酶能把目的基因與載體黏性末端的堿基對連接起來；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時采用顯微注射技術(shù)；④受精卵是理想的受體。A.①②④B.①③④C.②③④D.①②③④4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的方法正確的是（B）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中；②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中；③將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重