第三章 工業(yè)微生物的菌種選育課件

第三章工業(yè)微生物的

菌種選育第三章工業(yè)微生物的菌種選育工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價(jià)的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強(qiáng)

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求第三章工業(yè)微生物的菌種選育放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動物來源抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來源如下：

已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第三章工業(yè)微生物的菌種選育氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：第三章工業(yè)微生物的菌種選育氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌第三章工業(yè)微生物的菌種選育食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物開發(fā)一個(gè)新酶，都要經(jīng)過一系列研究的毒理試驗(yàn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌第三章工業(yè)微生物的菌種選育微生物（包括動、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛力。問題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？禮來(Elililly),花了10年的時(shí)間從40萬株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：第三章工業(yè)微生物的菌種選育新種分離與篩選的步驟定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。第一節(jié)自然選育第三章工業(yè)微生物的菌種選育

（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。第三章工業(yè)微生物的菌種選育從自然界篩選第三章工業(yè)微生物的菌種選育2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。第三章工業(yè)微生物的菌種選育（二）增殖培養(yǎng)

為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。第三章工業(yè)微生物的菌種選育富集的主要方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。第三章工業(yè)微生物的菌種選育定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時(shí)間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。第三章工業(yè)微生物的菌種選育菌落的選出

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時(shí)以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個(gè)重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。第三章工業(yè)微生物的菌種選育實(shí)例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻(xiàn):產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍(lán)＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個(gè)土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型↓第三章工業(yè)微生物的菌種選育（三）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。第三章工業(yè)微生物的菌種選育（四）篩選

這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第三章工業(yè)微生物的菌種選育（五）毒性試驗(yàn)

自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。第三章工業(yè)微生物的菌種選育第二節(jié)誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。問題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？回復(fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變

第三章工業(yè)微生物的菌種選育誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。具有速度快、收效大、方法簡便等特點(diǎn)。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

一、誘變劑和誘變處理物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實(shí)驗(yàn)室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險(xiǎn)性。第三章工業(yè)微生物的菌種選育化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。

第三章工業(yè)微生物的菌種選育使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑，設(shè)備簡單。而用電離輻射進(jìn)行工作時(shí)，設(shè)備費(fèi)用大，并要注意安全性。第三章工業(yè)微生物的菌種選育3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。第三章工業(yè)微生物的菌種選育誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。第三章工業(yè)微生物的菌種選育3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。第三章工業(yè)微生物的菌種選育二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第三章工業(yè)微生物的菌種選育(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第三章工業(yè)微生物的菌種選育5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對數(shù)期的細(xì)胞；有的作用于休止期，就可選用孢子。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。第三章工業(yè)微生物的菌種選育(三)誘變處理

根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實(shí)際，設(shè)計(jì)誘變處理方案。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

(四)中間培養(yǎng)

由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理性延遲)或基因處于不純的狀態(tài)（分離性延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個(gè)過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

方法：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí)，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。第三章工業(yè)微生物的菌種選育篩選的方法

隨機(jī)篩選

形態(tài)

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質(zhì)。(五)分離和篩選第三章工業(yè)微生物的菌種選育篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。第三章工業(yè)微生物的菌種選育紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。第三章工業(yè)微生物的菌種選育被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個(gè)／ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個(gè)／ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。第三章工業(yè)微生物的菌種選育操作步驟

1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。

2．將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)108個(gè)／ml左右，作為待處理菌懸液。

第三章工業(yè)微生物的菌種選育3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。

5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。

6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。

7．挑取菌落進(jìn)行篩選。第三章工業(yè)微生物的菌種選育亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。第三章工業(yè)微生物的菌種選育操作步驟糖（糖化酶及蛋白酶產(chǎn)生菌的誘變）

1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個(gè)／ml，此為待處理孢子懸液。

2．MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。第三章工業(yè)微生物的菌種選育3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1ml孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-3兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計(jì)數(shù)。

4．死亡率計(jì)算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。

5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．第三章工業(yè)微生物的菌種選育第三節(jié)雜交育種雜交育種一般指兩個(gè)不同基因型的菌株通過接合或者原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株的過程。第三章工業(yè)微生物的菌種選育一、常規(guī)雜交育種常規(guī)的雜交育不需要脫壁酶處理，就能使細(xì)胞結(jié)合發(fā)生遺傳物質(zhì)重新組合。細(xì)菌雜交酵母雜交第三章工業(yè)微生物的菌種選育二、原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

（一）原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)1、雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。2、受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。3、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程。第三章工業(yè)微生物的菌種選育4、存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能性。5、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。6、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。7、有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。第三章工業(yè)微生物的菌種選育（二）原生質(zhì)體融合育種步驟1．標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2．原生質(zhì)體制備。3．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6．生產(chǎn)性能篩選。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

（三）原生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn)1、標(biāo)記菌種的選擇獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實(shí)驗(yàn)室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

2、原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。第三章工業(yè)微生物的菌種選育

（四）影響原生質(zhì)體制備的因素1．菌體的前處理為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素、EDTA、甘氨酸等。2．菌體的培養(yǎng)時(shí)間

為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。