DB37T 4725.2-2024 動物疫病診斷技術 第2部分：α皰疹病毒

37毒Diagnostictechniquesofanimaldisease—Part2:AlphaherpesvirusI本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定DB37/T4725《動物疫病診斷技術》是針對畜禽養(yǎng)殖場不同動物疫病的致病原，明確動物疫病病原DB37/T4725擬由以下部分構成。皰疹病毒（herpesviruses）是一類有包膜、基因組為雙鏈DNA的病毒。主要分為α皰疹病毒、疹病毒、γ皰疹病毒3種亞型。其中α皰疹病毒對動物的危害程度最大。該病毒感染宿主廣泛，包括豬、1動物疫病診斷技術第2部分：α皰疹病毒本文件適用于豬、雞、牛、馬、驢α皰疹病毒的流行病學調查、診斷GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范4.1豬偽狂犬病由豬偽狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，P4.2雞馬立克氏病傳播，另外，污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動也可傳播該病。2月齡～5月齡的雞常4.3牛傳染性鼻氣管炎由牛皰疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，Bo由馬皰疹病毒1型、4型或8型（Equineherpesvirustype，2母豬分娩前或后1周出現(xiàn)食欲下降甚至廢絕，且出現(xiàn)早產，流產，產死胎或弱胎；公豬出現(xiàn)睪陰囊腫大，精子活力低。哺乳仔豬感染以后出現(xiàn)高熱潛伏期一般3周～4周，根據(jù)皰疹病毒侵害部位不同，分為四種類5.1.2.1神經型：患病雞出現(xiàn)站立不穩(wěn)，呈“劈叉”姿勢，翅膀下垂，低頭或斜頸等為典型癥狀。5.1.2.4皮膚型：病雞常出現(xiàn)毛囊腫大或皮膚結節(jié)。5.1.3.2結膜角膜炎型：病牛出現(xiàn)結膜和角膜充血，眼瞼腫大，流淚，角膜渾濁，有壞死性斑點。5.1.3.3生殖器型：病母牛體溫升高，精神沉郁，食欲廢絕，外陰腫脹有小膿皰；出現(xiàn)子宮炎導致流而死亡。孕馬或孕驢出現(xiàn)流產，或驢駒死亡。以1歲～2歲馬或驢多發(fā)，3歲后呈隱5.2.1.2聚合酶鏈式反應（PCR）檢測與電泳分析3TTTGAATTCTTACGACACGGC鑒于PRV的檢測需要區(qū)分野毒感染還是由疫苗免疫造成，以5.2.1.2純化的DNA為模板，利用特異性引物分別進行PCR檢測（引物序列見表2，gE引物用于鑒別野毒，gB引物用于常規(guī)檢測），qACAAGTTCAAGGCCCACATC5.2.1.4野毒分離與檢測分析核酸電泳結果，或qRT-PCR結果，選取判定為豬偽狂犬病毒陽性的腦，肺臟或淋巴結等病料借5.2.1.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.2.1采集病料樣品4具體操作步驟參照附錄A。將PCR產物利用1.0%的核酸膠進行電泳分析以5.2.2.2純化的DNA為模版，利用），MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTMDV073-R5.2.2.4野毒分離與檢測成3%FBSDMEM，放置培養(yǎng)箱3天～5天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。5.2.2.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.2.5.3若DEF細胞出現(xiàn)CPE，即細胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉5.2.3.1病料樣品采集以5.2.3.2純化的DNA為模板，利用），55.2.3.4野毒分離與檢測細胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3天～5天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。5.2.3.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.4.1病料樣品采集將待測病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模板，借助特異性引物（序列參見表5）進行PCR檢測，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產物利用1.0%核酸膠進行電泳分析，目的片段大小為792bp，482bp或6以5.2.4.2純化的DNA為模板，利用），5.2.4.4野毒分離與檢測換成3%FBSMEM，放置培養(yǎng)箱3天～5天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細胞病變（CPE）。5.2.4.5數(shù)據(jù)處理分析5.3綜合判定若患病動物（豬，雞，牛，馬或驢）出現(xiàn)呼吸困難，流產和神經癥狀等，則可判定為疑似α皰疹病毒感染，需借助PCR，熒光定量PCR進行7聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)，又稱為無細胞和適溫延伸（72℃)等3個步驟反復的熱循環(huán)構成。體系包含DNA聚合酶，引物，模板等，常設定為30A.3試劑或材料A.3.2對應靶基因的特異性引物。A.3.3實驗室用水參考GB/T66A.3.6Agarose瓊脂糖。A.3.7標準DNA分子量maker。A.4儀器設備A.4.2核酸電泳儀。A.5試驗步驟用1.0%核酸膠進行分析，待電泳結束，借助凝膠成像系統(tǒng)觀察11268qRT-PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PC11179TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGAGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGTCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGAGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGATTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGAACAACAGCGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTAATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTTACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGGGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCTGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGC.8牛皰疹病毒1型gB基因qRT-PCR參考序列(大小為97CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCACCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGGAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGGCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGGATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGCACGTCAACGTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGGTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAGAGTGGCGGAAACAATAGCGCTTGGGTTAACCTTTACCATCTCATTCCAGAGGGTCCGCTGTTTTGTAGTGTACACCACGCAGTTGCTATCCTACTTAGCATCTCATTAACGTGGGATTGGATGTGATCGTATGCAAACTGTAGCCAAACTCAATAGAGGACGTTGTTTTGATTAGCTCTAGTTGTTTGGCGGTGACGTTGGAAGAGTTTGTACTATTCGCAGCCTCCCGTTTGTGTAGGCGATGTAGTATTTGTTCTCTGTGGAGGCTCTCTTGGGTTGGAGTAGGTTCTGGTATTGATAGTAGCGACCTGTCGATTGGTATTATGGTTTGCGTTGGGGTTTAACAGATTTTTTAGGTCATAGG