辣椒炭疽病抗性室內(nèi)鑒定技術(shù)規(guī)程

2辣椒炭疽病抗性室內(nèi)鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了辣椒炭疽病室內(nèi)鑒定所需接種體制備方法、抗性鑒定方法、病情調(diào)查方法、抗性鑒定評(píng)價(jià)方法以及記載表格技術(shù)內(nèi)容。本文件適用于辣椒品種（系）在室內(nèi)條件下對(duì)炭疽病抗性水平的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T2060.1辣椒抗性鑒定技術(shù)規(guī)程第1部分：辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4材料準(zhǔn)備4.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基制備（PDA，PotatoDextroseAgar）馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂18g，加水定容至1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌25min，冷卻備4.2病原菌準(zhǔn)備4.2.1病原菌分離采用常規(guī)組織分離法，從辣椒果實(shí)病斑處分離純化后獲得病原菌。4.2.2病原菌鑒定采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定方法確定病原菌種類，分子鑒定方法詳見附錄A。4.2.3病原菌活化病原菌于PDA培養(yǎng)基活化后，再轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7天后備用。34.3對(duì)照品種選擇感病對(duì)照品種：‘茄門甜椒’。抗病對(duì)照品種：‘PBC932’，亞蔬-世界蔬菜中心。4.4鑒定材料準(zhǔn)備鑒定材料播種、育苗、定植、水肥管理、采摘按常規(guī)田間管理進(jìn)行，采摘前2周不噴施殺菌劑。采摘果實(shí)形狀、大小一致的綠熟果，清水洗凈后晾干，放入75%乙醇溶液中浸泡5min，無菌水沖洗干凈，置于超凈工作臺(tái)中晾干，備用。5室內(nèi)抗性鑒定5.1接種方法無菌接種針刺傷離體綠熟果表皮，根據(jù)果實(shí)大小，每個(gè)果實(shí)3~4個(gè)傷口，傷口深1mm~2mm，直徑1.5mm~2mm，使用3mm瓊擴(kuò)打孔器，沿活化后的菌落邊緣打取接種菌塊。菌塊菌絲面貼附于帶辣椒果實(shí)表面?zhèn)谔?，并進(jìn)行菌餅固定。5.2接種后管理接種后辣椒果實(shí)置于保鮮盒中，用保鮮膜密封后至于溫度為28℃、濕度為90%以上條件下暗培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后將濕度降為40%~50%，于接種后第7d統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。5.3病情調(diào)查根據(jù)辣椒炭疽病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表1），記錄接種辣椒果實(shí)炭疽病發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)（DI）=∑(各級(jí)病斑數(shù)×該病級(jí)代表數(shù)值)／(調(diào)查病斑總數(shù)×調(diào)查最高級(jí)值)×100表1辣椒炭疽病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)10213243545.4抗病性評(píng)價(jià)當(dāng)感病對(duì)照的病情指數(shù)（DI）＞30，抗炭疽病鑒定即為有效。依據(jù)病情指數(shù)對(duì)不同辣椒品種抗性級(jí)別進(jìn)行劃分，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。表2辣椒炭疽病抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)06記載表格參照NY/T2060.1的記錄方法，將統(tǒng)計(jì)鑒定結(jié)果記載在附錄B中。5附錄A辣椒炭疽病分離物分子鑒定方法采用CTAB法提取各菌株DNA，PCR擴(kuò)增各個(gè)菌株的ITS、TUB、GAPDH、ACT、CAL和CHS共6個(gè)基因序列，測(cè)序后將獲得的序列分別在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確定基因序列與已知炭疽菌種相似；將相似炭疽菌種作為參照菌株，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其對(duì)應(yīng)基因序列用于聚類分析，將所有比對(duì)菌株基因序列按照ITS-TUB-GAPDH-ACT-CAL-CHS的順序首尾相連拼接；利用MEGA（vision5.