《從實(shí)戰(zhàn)到實(shí)例：多次跨膜蛋白一體化研究方案分享》

從實(shí)戰(zhàn)到實(shí)例：多次跨膜蛋白一體化研究方案分享北京義翹神州科技股份有限公司CONTENT膜蛋白研究重要性及進(jìn)展概述1膜蛋白開發(fā)全攻略及技術(shù)平臺(tái)搭建2膜蛋白制備過程中常見問題及解決方案3膜蛋白制備相關(guān)案例分享4義翹神州膜蛋白研究重要性及進(jìn)展概述01義翹神州膜蛋白的功能膜蛋白是指能夠結(jié)合或整合到細(xì)胞或細(xì)胞器的膜上的蛋白質(zhì)的總稱，在細(xì)胞的跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量轉(zhuǎn)化、信息傳導(dǎo)、膜穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮著不可替代的作用。(2021,MolecularPlant)義翹神州膜蛋白分類依據(jù)與膜結(jié)合的強(qiáng)度及位置可分為3類：

-螺旋單次跨膜

-螺旋多次跨膜

-折疊桶

-螺旋錨定蛋白脂錨定蛋白外周膜蛋白外周膜蛋白整合膜蛋白脂錨定蛋白（Book,2002,MolecularBiology

oftheCell.4thedition）義翹神州膜蛋白特點(diǎn)0102030405非水溶性蛋白1）存在于膜上，需要脂質(zhì)包裹或去垢劑包裹才可溶蛋白表達(dá)量低1）內(nèi)源表達(dá)量存在組織特異性2）外源過表達(dá)后對(duì)細(xì)胞有損傷制備困難1）組織中提取周期長(zhǎng)，而且獲得大量組織不易2）外源過表達(dá)后提取工藝相對(duì)復(fù)雜蛋白收率低1）蛋白表達(dá)后純化過程損失樣品2）樣品表達(dá)量低，容易包裹脂類等物質(zhì)，樣品純度相對(duì)低樣品不穩(wěn)定1）蛋白與膜分離后，難維持正常構(gòu)象2）易聚集和失去活性義翹神州膜蛋白研究現(xiàn)狀G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），也稱為七次跨膜受體是真核生物中最大和最多樣化的膜受體蛋白家族。人類的許多疾病如癌癥，阿爾茲海默癥，帕金森等疾病都與膜蛋白功能異常有關(guān)，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前50%的小分子藥物的受體為膜蛋白，所以膜蛋白是重要的藥物靶點(diǎn)。膜蛋白功能研究，判定為重要靶點(diǎn)膜蛋白結(jié)構(gòu)探索基于膜蛋白的抗體藥研究原材料匱乏檢測(cè)方法不完備義翹神州膜蛋白開發(fā)全攻略及技術(shù)平臺(tái)搭建02VLP展示平臺(tái)去垢劑Detergent平臺(tái)納米盤Nanodiscs平臺(tái)義翹神州VLP展示目標(biāo)蛋白的過程VLP展示平臺(tái)病毒樣顆粒（virus-likeparticles,VLPs）基于結(jié)構(gòu)蛋白通過自組裝而形成的納米級(jí)顆粒的原理

不含病毒核酸，不能進(jìn)行自主復(fù)制，生產(chǎn)操作過程中較為安全義翹神州去垢劑平臺(tái)去垢劑溶解膜蛋白的過程去垢劑

是兩親性分子形成微團(tuán)-臨界膠束濃度（CMC）

微團(tuán)-去污劑提取整合膜蛋白的基礎(chǔ)義翹神州納米盤平臺(tái)SMA-NanodiscsSMA-Nanodisc組裝過程（2016，BiophysicsinEurope）SMA是一個(gè)共聚物從細(xì)胞膜上直接提取膜蛋白可自組裝義翹神州MSP-NanodiscsMSP-Nanodiscs的組裝過程（2021，Actapharmaceuticasinica）MSP是一個(gè)支架蛋白可自組裝能夠包裹磷脂形成納米盤需要基于Detergent制備的樣品完成組裝義翹神州納米盤平臺(tái)膜蛋白不同平臺(tái)優(yōu)劣勢(shì)情況指標(biāo)VLPDetergentSMA-NanodiscsMSP-NanodiscsElisa包被可直接包不可直接包可直接包可直接包活性較好最好較好較好穩(wěn)定性較穩(wěn)定不穩(wěn)定較穩(wěn)定較穩(wěn)定純度混合物較純-只有目標(biāo)蛋白較純-只有目標(biāo)蛋白相對(duì)較純--明確有目標(biāo)蛋白和MSP蛋白SPR/BLI可檢測(cè)可檢測(cè)，需溶液做調(diào)整適合檢測(cè)適合檢測(cè)需考慮因素濃度為總蛋白濃度；制備周期相對(duì)較短制備周期相對(duì)較長(zhǎng)；成本較高制備周期相對(duì)較長(zhǎng)；成本較高制備周期很長(zhǎng)；成本最高義翹神州膜蛋白制備過程中常見問題及解決方案03義翹神州重組膜蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素載體/宿主序列載體選擇宿主選擇培養(yǎng)條件培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染方式培養(yǎng)溫度和時(shí)間去垢劑選擇標(biāo)簽選擇組裝方式選擇純化方法義翹神州重組膜蛋白表達(dá)體系E.coli經(jīng)濟(jì)快速無糖基化修飾翻譯后修飾受限Yeast經(jīng)濟(jì)快速有部分翻譯后修飾非人源糖基化會(huì)出現(xiàn)過度糖基化與哺乳動(dòng)物的脂類不同Insect

cells高細(xì)胞密度相對(duì)高產(chǎn)量有糖基化和適當(dāng)?shù)姆g后修飾功能，比哺乳動(dòng)物體系簡(jiǎn)單比原核和酵母表達(dá)體系成本高，與哺乳動(dòng)物的脂類不同周期長(zhǎng)Mammaliancells可以選擇不同細(xì)胞系具有完整的翻譯后修飾功能和最完美的生理環(huán)境成本較高周期相對(duì)較長(zhǎng)義翹神州重組膜蛋白制備流程膜脂提取膜脂增溶蛋白純化質(zhì)量檢測(cè)基因合成載體構(gòu)建細(xì)胞轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染蛋白表達(dá)細(xì)胞收集細(xì)胞破碎用作水溶性蛋白質(zhì)純化的層析技術(shù)，同樣可以用作膜蛋白的純化，但去垢劑的存在是必須要考慮的因素。義翹神州重組膜蛋白制備過程遇到的問題問題蛋白不表達(dá)表達(dá)量低去垢劑選擇蛋白不穩(wěn)定蛋白純度低蛋白易聚集義翹神州解決方案蛋白不表達(dá)表達(dá)量低蛋白純度低蛋白不穩(wěn)定對(duì)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化構(gòu)建合適的序列片段添加促溶標(biāo)簽添加輔助蛋白改變表達(dá)宿主蛋白易聚集添加輔助蛋白，以保證其正確構(gòu)象利用Flag，Strep等填料進(jìn)行純化對(duì)某些可能引起聚集結(jié)構(gòu)域進(jìn)行截短或突變調(diào)整溶液緩沖體系添加還原劑置換不同的去垢劑或者加入一些添加劑義翹神州解決方案

去垢劑由親水頭基和疏水鏈尾部組成，根據(jù)親水頭基的不同，分為如下3個(gè)類型：去垢劑類型代表優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)非離子型TritonX-100;DDM一般比較溫和，不易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；廣泛使用可能導(dǎo)致溶解產(chǎn)量較低離子型SDS對(duì)于膜蛋白溶解非常有效通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,對(duì)離子交換層析產(chǎn)生干擾兼性離子型CHAPS通常用于膜蛋白結(jié)晶，結(jié)合了離子型和非離子型去垢劑的優(yōu)點(diǎn)比非離子型去垢劑更易導(dǎo)致蛋白變性去垢劑選擇義翹神州重組膜蛋白制備過程中去垢劑置換方法去垢劑全稱簡(jiǎn)稱臨界膠束濃度（CMC）n-Nonyl-β-D-Maltopyranosideβ-NM0.28%n-Nonyl-β-D-Glucopyranosideβ-NG0.2%n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideLDAO0.023%4-Cyclohexyl-1-Butyl-β-D-MaltosideCYMAL40.37%分子篩純化-去垢劑置換親和層析階段蛋白沉淀在填料上置換不徹底分子篩純化階段蛋白變性堵塞層析柱置換后蛋白均一性變差去垢劑置換義翹神州不同去垢劑下蛋白的狀態(tài)存在差異去垢劑1去垢劑4去垢劑3去垢劑2膜蛋白產(chǎn)品及案例分享04義翹神州產(chǎn)品開發(fā)方向7次跨膜的GPCR類蛋白eg.GPRC5D14次跨膜的CLDNs家族蛋白eg.Claudin6,18.22按客戶需求開發(fā)

3義翹神州案例分享靶點(diǎn)GPRC5D利用AlphaFold預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)：GPRC5DAF-Q9NZD1-F1-modelGPRC5D幾乎不在正常組織上表達(dá)，通常僅在毛囊細(xì)胞中表達(dá)，在多發(fā)性骨髓瘤患者中觀察到GPRC5D高表達(dá)。義翹神州ELISA檢測(cè)：批間穩(wěn)定性高

經(jīng)ELISA驗(yàn)證，

BiotinylatedHumanGPRC5D-VLP(FullLength)Protein（24447-HNAH-B）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，EC50范圍為4-12ng/mL。經(jīng)ELISA驗(yàn)證，HumanGPRC5D-VLP(FullLength)Protein（24447-HNAH）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，EC50范圍為3-10ng/mL。膜蛋白GPRC5D-VLP產(chǎn)品義翹神州ImmobilizedHumanGPRC5D-VLP(FullLength)Protein(Cat:24447-HNAH)at5μg/mL(100μL/well)canbindanti-GPRC5DAntibody,theEC50

is3-10ng/mL.ImmobilizedBiotinylatedHumanGPRC5D-VLP(FullLength)Protein(Cat:24447-HNAH-B)at5μg/mL(100μL/well)onstreptavidinprecoated(2μg/well)canbindAnti-Human

GPRC5D

Antibody,theEC50

is4-12ng/mL.ImmobilizedHumanGPRC5D-VLP(FullLength)Protein(Cat:24447-HNAH)at5μg/mL(100μL/well)canbindanti-GPRC5DAntibody.經(jīng)ELISA驗(yàn)證，

HumanGPRC5D-DetergentProtein（24447-H18H-DD）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，EC50值為4.0

ng/mL。經(jīng)BLI驗(yàn)證，

HumanGPRC5D-DetergentProtein（24447-H18H-DD）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，親和力為58.1

nM。SDS膜蛋白GPRC5D-Detergent產(chǎn)品義翹神州GPRC5DImmobilizedHumanGPRC5D-DetergentProtein(Cat:24447-H18H-DD)at5μg/mL(100μL/well)onNickel

coated

platecanbindAnti-Human

GPRC5D

Antibody,

HumanIgG1,theEC50

is4.0ng/ml（QCtested).LoadedAnti-GPRC5DAntibodyonProteinABiosensor,canbindHumanGPRC5D-DetergentProtein(Cat:24447-H18H-DD)withanaffinityconstantof58.1nMasdeterminedinBLIassay(ForteBioOctetRed384)(Routinelytested).經(jīng)SPR驗(yàn)證，

HumanGPRC5D-NanodiscProtein（24447-H18H-NA）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，親和力為9.6nM。經(jīng)ELISA驗(yàn)證，

HumanGPRC5D-NanodiscProtein（24447-H18H-NA）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，EC50值為20.6ng/mL。經(jīng)BLI驗(yàn)證，HumanGPRC5D-NanodiscProtein（24447-H18H-NA）可與抗GPRC5D抗體特異性結(jié)合，親和力為0.78nM。膜蛋白GPRC5D-Nanodiscs產(chǎn)品義翹神州LoadedAnti-GPRC5DantibodyonProABiosensor,canbindHumanGPRC5D-NanodiscProtein(Cat:24447-H18H-NA)withanaffinityconstantof0.78nMasdeterminedinBLIassay(ForteBioOctetRed384)(Routinelytested).CapturedAnti-GPRC5Dantibody

on

anti-HumanIgGFcviaCM5Chip

can

bindHumanGPRC5D-NanodiscProtein(Cat:24447-H18H-NA)with

an

affinity

constant

of

9.609nM

as

determined

in

a

SPR

assay(Biacore

T200)

(Routinelytested).ImmobilizedHumanGPRC5D-NanodiscProtein(Cat:24447-H18H-NA)at5μg/mL(100μL/well)canbindAnti-Human

GPRC5D

Antibody,

HumanIgG1,theEC50

is20.6ng/mL（QCtested).案例分享CLDNs家族CLDNs家族結(jié)構(gòu)示意圖上皮細(xì)胞和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)之間緊密連接位置的示意圖CLDNs家族蛋白通過細(xì)胞屏障、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)保持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。(2010,JournalofOncology)(2021,MolecularMedicineReports)義翹神州SignalturesequenceDisulfidebondLon-bindingsite1stECL:Pore-liningloop2stECL:Putativetrans-interactiondomain&CPE-bindingsiteNH2PalmitoylationsitesTraffickingandphosphorylationsignalsCOOHPDZ-bindingmotifCLDNs家族-Claudin1,6,9,18.2（2015，Hepatology）義翹神州介導(dǎo)丙型肝炎病毒HCV進(jìn)入靶細(xì)胞(2021，InternationalJournalofBiologicalSciences)Claudin

18.2蛋白在正常組織中表達(dá)高度受限在多種原發(fā)性惡性腫瘤中出現(xiàn)異常高表達(dá)實(shí)體腫瘤治療的

理想靶標(biāo)經(jīng)ELISA驗(yàn)證，Claudin18.2-VLP（30025-HNAH）可與抗體藥特異性結(jié)合，EC50范圍為5-20ng/mL。經(jīng)ELISA驗(yàn)證，Claudin6-VLP（16658-HNAH）可與抗體特異性結(jié)合，EC50范圍為2-10ng/mL。膜蛋白CLDN6/18.2-VLP產(chǎn)品義翹神州ImmobilizedHumanClaudin18.2-VLP(FullLength)Protein(Cat:30025-HNAH)at5μg/mL(100μL/well)canbindAnti-Humanclaudin18.2Antibody,HumanIgG1,theEC50is5-20ng/mL.ImmobilizedHumanCLDN6-VLP(FullLength)Protein(Cat:16658-HNAH)at5μg/mL(100μL/well)canbindAnti-HumanCLDN6Antibody,HumanIgG1,theEC50is2-10ng/mL.膜蛋白Claudin-6/18.2-Detergent產(chǎn)品經(jīng)ELISA驗(yàn)證，HumanClaudin-6-DetergentProtein（16658-H61H-DD）可與抗體特異性結(jié)合，EC50值為8.2

ng/mL。經(jīng)ELISA驗(yàn)證，HumanClaudin-18.2-DetergentProtein（30025-H64H-DD）可與抗體特異性結(jié)合，EC50值為8.4

ng/mL。義翹神州ImmobilizedHumanClaudin-6-DetergentProtein(Cat:16658-H61H-DD)at5μg/mL(100μL/well)onNickel

coated

platecanbindAnti-Human

Claudin-6

Antibody,

theEC50

is8.2ng/ml（QCtested).ImmobilizedHumanClaudin-18.2-DetergentProtein(Cat:30025-H64H-DD)at5μg/mL(100μL/well)onNickel

coated

platecanbindAnti-Human

Claudin-18.2

Antibody,theEC50

is8.4ng/ml（QCtested).膜蛋白Claudin-6-Nanodiscs產(chǎn)品經(jīng)ELISA驗(yàn)證，

HumanClaudin-6

-NanodiscProtein

（16658-H61H-NA）可與抗體特異性結(jié)合，EC50值為5.4ng/mL。SDSClaudin6義翹神州經(jīng)BLI驗(yàn)證，

HumanClaudin-6-NanodiscProtein(16658-H61H-NA)可與抗體特異性結(jié)合，親和力為0.536nM。LoadedAnti-Claudin-6antibodyonProABiosensor,canbindHumanClaudin-6-NanodiscProtein(Cat:16658-H61H-NA)withanaffinityconstantof0.536nMasdeterminedinBLIassay(ForteBioOctetRed384)(Routinelytested).ImmobilizedHumanClaudin-6

-NanodiscProtein(Cat:16658-H61H-NA)at5μg/mL(100μL/well)canbindAnti-Human

Claudin-6

Antibody,theEC50

is5.4ng/mL（QCtested).膜蛋白Claudin-18.2-SMA-Nanodiscs產(chǎn)品經(jīng)BLI驗(yàn)證，HumanClaudin-18.2-NanodiscProtein(30025-H64H-NA)可與抗Claudin18.2抗體特異性結(jié)合，親和力為4.3

nM。SDSClaudin18.2義翹神州LoadedAnti-Claudin-18.2antibodyonProABiosensor,canbindHumanClaudin-18.2-NanodiscProtein(Cat:30025-H64H-NA)withanaffinityconstantof4.3nMasdeterminedinBLIassay(ForteBioOctetRed384)(Routinelytested).經(jīng)ELISA驗(yàn)證，

HumanClaudin-18.2-NanodiscProtein

（30025-H64H-NA）可與抗體特異性結(jié)合，EC50的范圍為5-15ng/mLImmobilizedHumanClaudin-18.2-NanodiscProtein(Cat:30025-H61H-NA)at5μg/mL(100μL/well)canbindAnti-Human

claudin18.2

Antibody,

HumanIgG1,theEC50is5-15ng/mL.義翹膜蛋白產(chǎn)品靶點(diǎn)分子形式產(chǎn)品貨號(hào)GPRC5DVLP24447-HNAHClaudin-18.2VLP30025-HNAHClaudin-6VLP16658-HNAHBiotin-GPRC5DVLP24447-HNAH-B