DB15T 2835-2022馬駑巴貝斯蟲檢測 PCR法

ICS65.020.30

CCSB41

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2835—2022

馬駑巴貝斯蟲檢測PCR法

PCRmethodfordetectionofbabesiosiscaballi

2022-12-08發(fā)布2023-01-08實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2835—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。

本文件起草單位：中華人民共和國二連海關(guān)、內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理評(píng)審查驗(yàn)中心。

本文件主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、常鴻、包勇敢、荊文魁、騰克、趙治國。

I

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馬駑巴貝斯蟲檢測PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了馬駑巴貝斯蟲PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。

本文件適用于馬屬動(dòng)物馬駑巴貝斯蟲病的分子生物學(xué)診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

馬駑巴貝斯蟲babesiosiscaballi

馬駑巴貝斯蟲是引起馬駑巴貝斯蟲病的病原體，是一種寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞

內(nèi)的血液原蟲。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR

用于擴(kuò)增位于已知序列之間DNA（deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸）的方法。模板DNA經(jīng)過

高溫變性成單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條互不互補(bǔ)的寡核苷酸片段即引物分別于模板DNA兩

條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種dNTP（deoxyribonucleoside

triphosphate，脫氧核苷酸三磷酸）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)變性、退火和DNA合成這

一循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增，經(jīng)25～30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到106。

實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timePCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過程。

Ct值cyclethreshold

1

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每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

bp:堿基對(duì)(basepair)

CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)

DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)

FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）

TAMRA:羧基四甲基羅丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)

Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

5試劑與材料

水：符合GB/T6682的要求。

DNA提取試劑盒。

CTAB。

Tris-HCl(pH8.0)。

NaCl。

EDTA。

蛋白酶K溶液(20mg/mL)。

三氯甲烷。

異丙醇。

75%乙醇。

Taq酶。

dNTP（2.5mmol/L）。

PCRbuffer。

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker）（50bp～500bp）。

實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液。

陽性對(duì)照樣品：采用已知含有馬駑巴貝斯蟲的DNA，或經(jīng)測序確認(rèn)的陽性質(zhì)粒。見附錄B。

陰性對(duì)照樣品：采用已知不含有馬駑巴貝斯蟲的DNA。

空白對(duì)照：ddH2O。

引物及探針:見表1。

2

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表1馬駑巴貝斯蟲檢測引物及探針

檢測方法引物/探針序列（5’-3’）擴(kuò)增片段

上游引物

5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′

（F）

PCR法200bp

下游引物

5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′

（R）

上游引物

5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′

（F）

實(shí)時(shí)熒光PCR法200bp

下游引物

5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′

（R）

探針（P）5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3′

6儀器與設(shè)備

PCR儀。

凝膠成像儀。

實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

高速臺(tái)式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000rpm）。

旋渦振蕩器（最高轉(zhuǎn)速3000rpm）。

核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。

恒溫水浴鍋。

天平（感量0.01g）。

單孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。

7樣品采集

使用添加EDTA抗凝劑的采樣管無菌采集血樣。

8檢測方法

PCR法

8.1.1樣品的總DNA提取

參照附錄A中提取樣品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的血液DNA提取試劑盒進(jìn)行。當(dāng)DNA

濃度吸光度值A(chǔ)260/A280在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。設(shè)置至少兩個(gè)平行樣品且需設(shè)立陰性、陽性

及空白提取對(duì)照。

8.1.2PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系為50L，體系組成見表2。

3

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表2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成

試劑名稱貯備液濃度反應(yīng)體系體積L

10×Buffer(含Mg2+)－5

Taq酶5U/L0.25

dNTP2.5mmol/L5

上游引物（F）10mol/L2

下游引物（R）10mol/L2

模板－2

ddH2O－補(bǔ)足至50

檢測過程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白提取對(duì)照。

8.1.3PCR反應(yīng)條件

預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，30s；延伸退火：58℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸

5min；4℃保存。

8.1.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液

面剛剛沒過凝膠。將5L～8LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合點(diǎn)樣。9V/cm恒壓電泳，直

至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并記錄。

8.1.5結(jié)果判定與表述

8.1.5.1質(zhì)量控制

質(zhì)控對(duì)照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：

a)陽性對(duì)照:出現(xiàn)200bp的特異性條帶；

b)陰性對(duì)照：不出現(xiàn)200bp的特異性條帶；

c)空白對(duì)照：不出現(xiàn)200bp的特異性條帶。

8.1.5.2結(jié)果判定

8.1.5.2.1質(zhì)控對(duì)照成立條件下，兩個(gè)平行樣品均出現(xiàn)200bp的特異性條帶為陽性。

8.1.5.2.2質(zhì)控對(duì)照成立條件下，兩個(gè)平行樣品均不出現(xiàn)200bp的特異性條帶為陰性。

8.1.5.3結(jié)果表述

8.1.5.3.1PCR產(chǎn)物為陽性者，表述為“檢出馬駑巴貝斯蟲”。

8.1.5.3.2PCR產(chǎn)物為陰性者，表述為“未檢出馬駑巴貝斯蟲”。

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

8.2.1樣品的總DNA提取

同7.1.1操作。

8.2.2熒光定量PCR擴(kuò)增

4

DB15/T2835—2022

反應(yīng)體系體積為25L，見表3。

表3熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成

試劑名稱貯備液濃度mol/L反應(yīng)體系體積L

PCR反應(yīng)預(yù)混合液—12.5

上游引物（F）101

下游引物（R）101

探針（P）101

模板—2

ddH2O—補(bǔ)足至總體積為25

檢測過程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白提取對(duì)照。

8.2.3反應(yīng)條件

預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，15s；延伸退火：58℃，1min，40個(gè)循環(huán)。在58℃時(shí)

收集熒光信號(hào)值。

8.2.4結(jié)果判定與表述

8.2.4.1質(zhì)量控制

質(zhì)控對(duì)照應(yīng)滿足以下條件，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)：

a)空白對(duì)照：無熒光對(duì)數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值大于等于40.0；

b)陰性對(duì)照：無熒光對(duì)數(shù)增長，相應(yīng)的Ct值大于等于40.0；

c)陽性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值小于等于35.0。

8.2.4.2結(jié)果判定

8.2.4.2.1質(zhì)控對(duì)照成立條件下，2個(gè)平行樣檢測結(jié)果Ct值大于等于40.0，可判定被檢樣品為陰性。

8.2.4.2.2質(zhì)控對(duì)照成立條件下，2個(gè)平行樣檢測結(jié)果Ct值小于等于35.0，可判定被檢樣品為陽性。

8.2.4.2.3質(zhì)控對(duì)照成立條件下，至少1個(gè)平行樣檢測結(jié)果Ct值35.0～40.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲

線，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加DNA模板量重做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。再次檢測結(jié)果仍然Ct值小于40.0，并出現(xiàn)典

型的擴(kuò)增曲線，可判定被檢樣品為陽性；再次檢測結(jié)果Ct值大于等于40.0，可判定被檢樣品為陰性。

8.2.4.3結(jié)果表述

8.2.4.3.1檢測結(jié)果為陽性者，表述為“檢出馬駑巴貝斯蟲”。

8.2.4.3.2檢測結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出馬駑巴貝斯蟲”。

9防止交叉污染措施

檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。

5

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A

A

附錄A

（資料性）

溶液配制及提取方法

A.1CTAB-提取緩沖液

將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0

后，定容至250mL，115℃高壓15min。

A.2CTAB-沉淀液

稱0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高壓15min。

A.31.2mol/LNaCl溶液：

稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15min。

A.4DNA提取方法：

A.4.1稱取樣品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12L～20L蛋白酶K（根據(jù)

CTAB量調(diào)節(jié)），每個(gè)樣品提取2管，同時(shí)用水做空白提取對(duì)照?；靹蚝?5℃至少1h(過夜孵育最好)，如

樣品膨脹，則可再多加CTAB,每次多1mL，最多10mL。

A.4.24000rpm/min～5000r/min離心10min。

A.4.3將上清（約1mL）加入無菌EP中（2mL管），加入700L氯仿，渦旋30s后，再12000rpm離心

10min。

A.4.4取上清600L～650L加入無菌EP管中，加入2倍體積的CTAB沉淀液，旋渦混勻，室溫靜置1

min。

A.4.512000rpm離心10min，去上清。沉淀溶解于350L的1.2mol/LNaCl溶液。（2管合并共用350

L溶液）。

A.4.6加入350L氯仿，渦旋30min，12000rpm離心10min。

A.4.7取上清液至無菌EP管中（確定體積），加入0.8倍體積的異丙醇，手搖混勻，室溫孵化至少20m

in，12000rpm離心10min，去上清，沉淀用500L75%的乙醇洗滌，再12000rpm離心10min。

A.4.8去上清后，干燥沉淀，60℃下15s～20s（開蓋倒立）。

A.4.9將沉淀溶于100L滅菌水或TEbuffer或DEPC水中。

6

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

馬駑巴貝斯蟲的目標(biāo)擴(kuò)增序列

CTCTCCAAAGTCTTAAGTACCCTCTTGAGGCTAAGTACCAACCGCTGACCCTTCCTGACCCCTACCAGTTGGAGGCCGCTTTTAT

ACTCTTCAAGGAGAGTGGCGCTAATCCGGCCAATAGCGCTGAGAAGCGTTTCTGGATGCGTTTCAAAAGGGGCAAGAACCACAGTTACT

TCCACGACTTAGTCTTCAATCTGCTG

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口。

本文件起草單位：中華人民共和國二連海關(guān)、內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理評(píng)審查驗(yàn)中心。

本文件主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、常鴻、包勇敢、荊文魁、騰克、趙治國。

I

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馬駑巴貝斯蟲檢測PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了馬駑巴貝斯蟲PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。

本文件適用于馬屬動(dòng)物馬駑巴貝斯蟲病的分子生物學(xué)診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

馬駑巴貝斯蟲babesiosiscaballi

馬駑巴貝斯蟲是引起馬駑巴貝斯蟲病的病原體，是一種寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞

內(nèi)的血液原蟲。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR

用于擴(kuò)增位于已知序列之間DNA（deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸）的方法。模板DNA經(jīng)過

高溫變性成單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條互不互補(bǔ)的寡核苷酸片段即引物分別于模板DNA兩

條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種dNTP（deoxyribonucleoside

triphosphate，脫氧核苷酸三磷酸）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)變性、退火和DNA合成這

一循環(huán)，使位于兩段已知