血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用

血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用作者：叢玉隆李祖蘭來源：檢驗(yàn)世界網(wǎng)自2002年衛(wèi)生部文件建議“廢除Duke法檢測(cè)出血時(shí)間、玻片法檢測(cè)凝血時(shí)間，建議應(yīng)用PT、APTT替代作為術(shù)前出血篩查”以來，凝血試驗(yàn)檢測(cè)在國(guó)內(nèi)發(fā)展迅速，使用凝血儀器的檔次在國(guó)際上也處于很高的水平，但在臨床應(yīng)用上距離國(guó)際水平還相差太遠(yuǎn)。我們現(xiàn)在所說的凝血檢測(cè)在絕大部分醫(yī)院中指的僅僅是凝血四項(xiàng)，或再加D二聚體檢測(cè)。實(shí)際上，凝血因子檢查遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些。以我科開展的項(xiàng)目為例，凝血因子檢查大約有幾十項(xiàng)。另一方面，血栓的形成與血管、血小板、凝（抗凝）血因子、血液粘稠度等因素都有重要的聯(lián)系，特別是血小板功能的變化。血小板功能的檢測(cè)在臨床上有很大的作用，而目前國(guó)內(nèi)在血小板功能的檢測(cè)項(xiàng)目的開展沒有得到應(yīng)有的重視，原因是實(shí)驗(yàn)室的臨床服務(wù)意識(shí)、實(shí)驗(yàn)室知識(shí)結(jié)構(gòu)、方法學(xué)質(zhì)量控制等因素限制了血小板功能檢測(cè)在國(guó)內(nèi)的開展。進(jìn)入二十一世紀(jì)，人類社會(huì)的老年時(shí)代也隨之而來。人口老齡化帶來的社會(huì)問題是疾病譜發(fā)生變化。建國(guó)初期我國(guó)死亡率最高的疾病是傳染病，之后為腫瘤；而進(jìn)入二十一世紀(jì)，隨著人口老齡化的出現(xiàn)，心腦血管疾病逐漸上升為死亡率最高的疾病，成為人類健康的第一殺手。其中，心腦血管疾病多半的機(jī)制都是血栓的形成，如因冠狀動(dòng)脈形成血栓導(dǎo)致的冠心病、腦血管、腦血栓等等都是由血栓引起的。同時(shí)，形成血栓的核心因素及第一要素就是血小板。當(dāng)前，年齡大于50歲以上的老年人，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血脂等的變化易患心腦血管疾病，很多老年人都在服用阿司匹林治療，那么阿司匹林服用劑量應(yīng)該為多少合適呢。劑量過小不會(huì)獲得治療效果，而劑量過大則容易導(dǎo)致血小板功能的過分抑制，導(dǎo)致自發(fā)性出血。但是目前80%-90%的醫(yī)院對(duì)服用阿司匹林后血小板功能監(jiān)測(cè)項(xiàng)目開展的很少，大大影響了臨床對(duì)心腦血管疾病的診斷和治療。凝血過程及血小板形成血栓的病理生理基礎(chǔ)正常情況下，血液每天都在血管內(nèi)流動(dòng)，為機(jī)體輸送氧氣，進(jìn)行氣體交換、新陳代謝、抗炎等，而不會(huì)出現(xiàn)血栓的現(xiàn)象。但一旦出現(xiàn)問題時(shí)，血管內(nèi)就會(huì)有血栓的形成，對(duì)受損部位進(jìn)行止血。機(jī)體既能保證血液正常流動(dòng)又不會(huì)凝固，而出現(xiàn)問題時(shí)又馬上止血的原因是正常生命活動(dòng)中，機(jī)體內(nèi)存在一種非常復(fù)雜的而又統(tǒng)一對(duì)立的生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)即抗凝系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)。抗凝系統(tǒng)和促凝系統(tǒng)在神經(jīng)和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)下處于動(dòng)態(tài)平衡，可保證血液中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等物質(zhì)處于正常作用，保證血管的完整性，保持血液呈液體狀態(tài)，既不出血，也不形成血栓。圖1為血管內(nèi)示意圖。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用在凝血系統(tǒng)中形成凝血抗凝對(duì)立統(tǒng)一系統(tǒng)的機(jī)制來源于血管特別是血管壁、血小板和血漿中的各種相關(guān)因子（如圖2所示）。其中血管壁包括血管壁的變化、血管壁的結(jié)構(gòu)、血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞壁釋放出的因子（促凝時(shí)釋放促凝因子，抗凝時(shí)釋放抗凝因子）。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用正常情況下機(jī)體以血管作為平臺(tái)、以血管內(nèi)皮細(xì)胞為總指揮調(diào)節(jié)血小板的功能，調(diào)節(jié)血漿中的各種因子變化，始終保持機(jī)體平衡。血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞均具有雙重作用。出血時(shí)，促凝系統(tǒng)發(fā)揮作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞首先暴露膠原蛋白，膠原隨后激活血小板，使血小板粘附、聚集并釋放凝血因子，這些凝血因子再激活其他一些相關(guān)因子，最后導(dǎo)致纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，形成血栓進(jìn)行止血。一旦止血成功后，血管修復(fù)了，就不再需要這些栓子，此時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞就釋放纖溶因子，促使纖溶酶原變?yōu)槔w溶酶，溶解纖維蛋白。如圖3所示。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用血小板在血栓形成的作用血小板結(jié)構(gòu)血小板結(jié)構(gòu)決定血小板功能。正常的血小板形狀不規(guī)則，無細(xì)胞核但有細(xì)胞器，是巨核細(xì)胞胞漿液剝落下來的脫離細(xì)胞。細(xì)胞中含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管微絲、高爾基體、線粒體、致密顆粒等結(jié)構(gòu)，其中較為特殊的、與血小板凝血作用緊密相關(guān)的結(jié)構(gòu)是致密顆粒，含有很多的凝血因子(如ADP、ATP)。見圖4。血小板處于正常靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，致密顆粒不會(huì)起到抗凝作用；而當(dāng)血小板一旦被活化后，致密顆粒、α顆粒收縮釋放各種物質(zhì)，然后這些物質(zhì)通過血小板內(nèi)的通道進(jìn)入到血小板外部的血漿內(nèi)，并與血漿中的凝血因子相互作用，促進(jìn)凝血過程。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用激活后血小板功能血小板被激活后的功能主要有：粘附，血小板附著在某物體的表面；聚集，血小板相互間的粘附；變形，血小板形態(tài)變化，白色血栓形成；釋放，釋放血小板內(nèi)容物，加強(qiáng)凝血因子、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞功能。其中，血小板這些功能的實(shí)現(xiàn)主要依賴的是血小板表面上的各種受體（見圖6），如與膠原結(jié)合的糖蛋白1、與粘附作用有關(guān)的糖蛋白Ⅰb、與聚集作用有關(guān)糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、凝血酶的受體糖蛋白Ⅴ。受體被激活后，血小板內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列的生理變化以及更加復(fù)雜的化學(xué)變化，如圖5、圖6所示，構(gòu)成了血栓形成的病理生理基礎(chǔ)。血小板功能檢測(cè)的的臨床應(yīng)用（一）血小板病的實(shí)驗(yàn)診斷（二）血栓前狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)診斷（三）抗血小板藥物治療監(jiān)測(cè)血小板檢查項(xiàng)目（一）一般檢查：1.血小板計(jì)數(shù);2.MPV;3.血塊回縮試驗(yàn)。（二）血小板功能檢查：1.血小板粘附試驗(yàn);2.血小板聚集試驗(yàn);3.血小板粘附集聚試驗(yàn);4.血栓彈力圖。其中血小板聚集試驗(yàn)方法有：(1)血小板集聚儀法；(2)VerifyNow儀法；(3)流式細(xì)胞術(shù)聚集法;(4)血小板粘附聚集試驗(yàn)用到的儀器為PF-100血小板粘附集聚儀。（三）特殊檢查：1.血小板釋放物包括致密顆粒的釋放（如血小板ATP釋放，5-TH測(cè)定）和α顆粒釋放（如PF4，β-TG，GMp-140）檢查;2.血小板AA代謝（如TXB2，丙二醛）檢查;3.血小板膜蛋白（如GPI，GPIIb和IIIa）;4.血小板內(nèi)鈣流、鈣波動(dòng)檢測(cè)。上述試驗(yàn)項(xiàng)目中最適合臨床常規(guī)診治工作是血小板聚集試驗(yàn)，各項(xiàng)血小板聚集試驗(yàn)的方法學(xué)原理大致是相同的，血小板聚集原理見圖-7。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用血小板表明有很多的受體和糖蛋白，其中比較重要的是糖蛋白IIb/IIIa。正常情況下這兩種糖蛋白以分開、游離形式存在。以ADP或AA受體為例，一旦在血漿中加入ADP或AA，它們就變?yōu)檎T導(dǎo)劑，跟血小板ADP或AA受體結(jié)合反應(yīng)，促使GPIIb與GPIIIa結(jié)合在一起形成GPIIb/IIIa結(jié)合物。之后，GPIIb/IIIa結(jié)合物與血漿中的纖維蛋白原結(jié)合，在一定鈣濃度情況下，血小板與血小板之間粘附、聚集、變形，形成血小板血栓。如圖8所示，血小板聚集試驗(yàn)獲得成功需要注意的要素有血小板濃度（血小板聚集的關(guān)鍵因素），相對(duì)應(yīng)受體的存在與否，誘導(dǎo)劑的質(zhì)量和濃度，鈣濃度（由抗凝劑加入量決定）等等。當(dāng)前血小板聚集試驗(yàn)最大問題就是對(duì)這些要素缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量控制。血小板集聚儀工作原理血小板集聚儀工作原理主要有兩種，濁度法和電阻法。濁度法是在富含血小板血漿（PRP）中加入致聚劑，血小板發(fā)生聚集，血漿濁度變化，透光度增加，將血小板聚集儀這種濁度變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并記錄，形成血小板聚集曲線。根據(jù)血小板聚集曲線可了解血小板聚集的程度和速度。電阻法（阻抗法）是根據(jù)電阻抗原理，通過放大、記錄浸泡在全血樣品中電極探針間的微小電流或阻抗的變化來測(cè)定全血樣品血小板聚集性的方法（如圖8所示）。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用PFA-100?血小板檢測(cè)儀PFA-100?是一款檢測(cè)血小板粘附聚集比較標(biāo)準(zhǔn)化的血小板檢測(cè)儀，早在上世紀(jì)90年代在國(guó)外就已進(jìn)入臨床使用，筆者在本世紀(jì)初曾進(jìn)行過方法學(xué)評(píng)價(jià)并做了一些科研課題，但其在國(guó)內(nèi)并沒有得到應(yīng)用。其優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)都很突出。優(yōu)勢(shì)是操作快速，簡(jiǎn)便，易于質(zhì)量控制；單一試劑包；已有不少的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表。缺點(diǎn)是試劑價(jià)格昂貴；易受受vWF,PCT,HCT，PLT等參數(shù)的影響；只有兩種試劑包（ADP、膠原），應(yīng)用范圍窄。圖9為該儀器的工作原理圖。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)可檢測(cè)血小板表面的抗原，可區(qū)分激活狀態(tài)和非激活狀態(tài)的血小板，激活狀態(tài)標(biāo)志物CD62/P-Selectin。但是該方法所用儀器和試劑都比較昂貴，操作復(fù)雜，需受過特別培訓(xùn)的技術(shù)人員。因此，該方法不能作為快速檢測(cè)項(xiàng)目。其檢測(cè)結(jié)果見圖11所示。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用VerifyNow抗血小板治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)VerifyNow抗血小板治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)操作流程如圖12所示。該儀器目前在國(guó)內(nèi)僅限于科研所用，其優(yōu)點(diǎn)包括：（1）快速，3分鐘內(nèi)出結(jié)果；樣本采集后只需等10鐘的樣本穩(wěn)定期；有AA、ADP、GPⅡb/Ⅲa三個(gè)受體檢查試劑盒；（2）簡(jiǎn)便，全血樣本—無需樣本預(yù)處理；無需專業(yè)培訓(xùn)的操作人員；全自動(dòng)操作，包括取樣、廠家定標(biāo)準(zhǔn)確；無需讓病人停藥檢測(cè)基礎(chǔ)值也能準(zhǔn)確得出血小板抑制百分比。但是，該儀器費(fèi)用昂貴。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用血栓彈力圖監(jiān)測(cè)血小板功能血栓彈力圖是對(duì)血小板功能動(dòng)態(tài)變化的描述，對(duì)血小板功能的監(jiān)測(cè)并不具備特異性，而且成本費(fèi)用極其昂貴，目前多用于術(shù)中作為快速檢查，判斷血液凝血系統(tǒng)的變化，以決定輸血治療的方案。比濁法血小板聚集儀方法學(xué)評(píng)價(jià)從上述的各類儀器的方法學(xué)比較可以看出比濁法血小板聚集儀最適我國(guó)使用，但檢驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性限制了它的普及，如果比濁法血小板集聚試驗(yàn)實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作，檢驗(yàn)結(jié)果能否反映血小板功能變化？比濁法血小板集聚試驗(yàn)?zāi)芊褡鳛槭走x的常規(guī)試驗(yàn)？為了回答這個(gè)困擾多年的臨床實(shí)際問題，筆者做了如下研究：研究對(duì)象為健康成年人例，每天服用100mg阿司匹林，連續(xù)服用三天后停藥。分別在服藥前、服藥后、開始停藥、停藥后2天、4天、6天、8天、10天從研究對(duì)象中抽血檢測(cè)血小板聚集率，所得結(jié)果如圖13所示。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是血小板在體內(nèi)的生命周期是9-10天，剛開始服用阿司匹林時(shí)，100%的血小板都被抑制，停藥后，每隔一天都有十分之一的血小板衰亡，并有十分之一的血小板生成，而新生成的血小板并沒有受到藥物的抑制作用。停藥后10天，受到藥物抑制的血小板全部衰亡，所以血小板聚集率恢復(fù)到服藥前的血小板聚集率。此外，作者采用流式法、放免法檢測(cè)到的血小板聚集率變化圖線幾乎與圖13中的曲線重合，證明了血小板聚集實(shí)驗(yàn)方法的可行性。但需建立嚴(yán)格的質(zhì)量管理措施。影響血小板聚集的各種因素及質(zhì)量控制血小板聚集試驗(yàn)要達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化會(huì)受到很多因素的影響（如圖14所示）。血小板功能檢測(cè)進(jìn)展及臨床應(yīng)用血小板濃度：反應(yīng)的血小板數(shù)最少為15萬(wàn)才能完成血小板聚集試驗(yàn)。血漿PH變化：未經(jīng)特殊處理的靜脈血標(biāo)本放置時(shí)間過長(zhǎng)，可影響血漿PH,直接影響檢測(cè)結(jié)果。抗凝劑種類：采用不同的抗凝劑所得結(jié)果是不一樣的，標(biāo)準(zhǔn)的抗凝劑是枸櫞酸鈉?？鼓齽┯昧浚赫＜t細(xì)胞比積血液與抗凝劑劑量比例必須為1:9，抗凝劑的多少直接關(guān)系到血漿游離鈣的含量。如果抗凝劑用量過大，會(huì)導(dǎo)致血漿內(nèi)鈣濃度偏低，無法完成凝集。但當(dāng)Hct過低（<20%)、過高（70%）,抗凝劑用量要做相應(yīng)調(diào)整。PFR保存的條件和時(shí)間血小板聚集儀工作狀態(tài)：試驗(yàn)中最容易忽略的是反應(yīng)杯的透光度，其次對(duì)結(jié)果有影響的易忽略的還有攪拌棒的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化程度。另外，聚集劑種類、濃度、劑量與保存及患者試驗(yàn)前服用抗凝藥物干擾都是引起試驗(yàn)誤差的常見因素對(duì)各種影響血小板聚集試驗(yàn)因素的研究（一）PRP血小板濃度對(duì)AA、ADP誘導(dǎo)血小板聚集影響如表1所示，采用300萬(wàn)或400萬(wàn)AA、ADP誘導(dǎo)血小板聚集時(shí)，血小板濃度必須至少在180萬(wàn)或150萬(wàn)以上才能出現(xiàn)血小板聚集。需要注意的是該研究采用的是血漿，與采用全血所得結(jié)果不同。（二）標(biāo)本的保存時(shí)間對(duì)血小板聚集率的影響標(biāo)本取出后必須加塞保存，否則血漿中CO