DBXM117-2021 露地辣椒疫病診斷與防治技術規(guī)程

ICSFORMTEXT65.020FORMTEXTCCSB05FORMTEXTDBFORMTEXT22DBFORMTEXT22/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2021FORMTEXTFORMTEXT露地辣椒疫病診斷與防治技術規(guī)程FORMTEXTRegulationfordiagnosisandcontrolagainstPepperBlightinfieldFORMTEXT點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識FORMDROPDOWNFORMTEXT（2021.11.26FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT吉林省市場監(jiān)督管理廳??發(fā)布DB22/XXXXX—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件中的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由吉林省農業(yè)農村廳提出并歸口。本文件起草單位：吉林農業(yè)大學本文件的主要起草人：王曉梅、陶淑霞、劉世杰、齊紅巖、葉雪凌、李宏俠、尹廣喜、王瑤、張丹、孫西琳、王國宇。露地辣椒疫病診斷與防治技術規(guī)程范圍本文件確立了露地辣椒疫病診斷與防治的程序，規(guī)定了癥狀診斷、病原菌診斷及綜合防治技術的操作指示。描述了記錄與檔案的追溯方法。本文件適用于露地辣椒疫病診斷及綜合防治。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8321（所有部分）農藥合理使用準則NY/T1276農藥安全使用規(guī)范總則術語和定義辣椒疫病pepperphytophthorablight由辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）侵染辣椒引起的一種菌物病害。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基potatodextroseagar，PDA一種用于分離和培養(yǎng)病原菌的營養(yǎng)基質。聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction，PCR一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術。交替用藥alternativeapplication選擇兩種或兩種以上無交互抗性的藥劑交替使用。混合用藥mixedapplication選擇兩種或兩種以上作用方式和機制不同、無交互抗性的藥劑混合使用。病害診斷癥狀診斷辣椒疫病苗期和成株期均可發(fā)病，以成株期發(fā)病為主，根、莖、葉和果實都能發(fā)病。苗期癥狀苗期發(fā)病，發(fā)病初期在莖基部形成暗綠色水漬狀病斑，之后植株會迅速因褐腐縊縮而猝倒；有時莖基部呈黑褐色，嚴重時幼苗會枯萎而死。成株期癥狀根部染病，發(fā)病初期呈淡褐色濕腐狀病斑，逐漸變?yōu)楹诤稚?，導致根部及根頸部韌皮部腐爛，木質部變淡褐色，引起整株萎蔫死亡，典型癥狀參見附錄A中圖A.1。莖和枝染病，發(fā)病初期病斑為水浸狀，環(huán)繞莖枝表面擴展，導致莖枝黑桿，病部以上枝葉迅速凋萎，典型癥狀參見附錄A中圖A.2。葉部染病，產生邊緣不明顯的黃綠色病斑，病斑呈圓形或近圓形，病葉很快濕腐脫落。果實染病，發(fā)病部位始于蒂部，發(fā)病初期產生暗綠色水浸狀病斑，后期逐漸擴大可遍及整個果實，病果迅速變褐軟腐，濕度大時，表面長出灰白色霉層，干燥后形成暗褐綠色僵果，殘留在枝上，典型癥狀參見附錄A中圖A.3。病原菌診斷顯微鏡觀察徒手制片取潔凈的載玻片，在載玻片中間滴一滴清水；用尖細的解剖針等直接挑取病部或培養(yǎng)基上的霉狀物，置清水中；盡量使病原物分散；加蓋蓋玻片，在加蓋蓋玻片時，要使蓋玻片的一側邊緣與水滴邊緣接觸，然后慢慢向下放蓋玻片，若蓋玻片下有氣泡應重新放置蓋玻片，待顯微觀察。鏡檢在普通光學顯微鏡物鏡10×10倍的視野下進行形態(tài)觀察。菌絲無色，無隔膜，形態(tài)圖參見附錄B中圖B.1。游動孢囊梗3根～5根成束由葉背氣孔伸出，具3個～4個分枝，其頂端膨大形成游動孢子囊，游動孢囊梗膨大呈節(jié)狀，頂端尖細,形態(tài)圖參見附錄B中圖B.2。游動孢子囊單胞無色，卵圓形，頂端有乳頭狀突起，大小為（23～40）μm×（18～22）μm,形態(tài)圖參見附錄B中圖B.3。分子檢測病原菌分離采集具有典型疫病病斑的辣椒病葉，在超凈工作臺上將病葉浸于75%酒精中表面消毒10s～30s，滅菌蒸餾水浸洗3遍，吸水紙吸干水后將病健交界處剪成5mm2～10mm2取4小塊病葉放置入PDA培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)2d～4d，待菌絲長出后將其轉移至新的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)3d～5d,待菌絲形成后，再進行純化。菌落圖參見附錄DNA提取采用CTAB法，提取病菌基因組DNA。具體方法按附錄C中的C.1的要求執(zhí)行。PCR擴增以基因組DNA為模板，采用通用引物ITS4/ITS5（ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’/ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）對病原物ITS區(qū)域擴增，PCR反應參數(shù)按附錄C中的C.2的要求執(zhí)行。PCR擴增產物檢測結果表明ITS片段大約為800bp，檢測結果參見附錄C中的圖BLAST比對PCR產物送交生物技術公司進行測序，測序結果在GenBank中進行BLAST比對分析，確定病原菌為辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）。辣椒疫霉菌的ITS序列參見附錄C中的C.4。綜合防治技術防治原則病害防治應采取“預防為主，綜合防治”的原則。在優(yōu)先選用和栽培抗病品種的基礎上，加強栽培管理，重視農業(yè)防治；科學利用化學防治，合理使用化學農藥，采用交替用藥和混合用藥的方式，控制好用藥次數(shù)，避免病原菌產生抗藥性。防治方法品種選擇根據(jù)辣椒品種栽培習性及各地氣候條件，有針對性的選擇抗病或耐病的辣椒品種，優(yōu)先選擇兼抗兩種以上辣椒病害的品種進行種植。農業(yè)防治合理輪作與非茄科作物特別是玉米、大豆及十字花科蔬菜、蔥蒜類蔬菜等進行3～5年以上輪作。清潔田園定植前徹底清理前茬作物的殘株、爛葉和雜草等；發(fā)現(xiàn)病株及時拔除，并帶出田外深埋或者燒毀；收獲后，也要徹底清除田間病殘體，集中燒毀。土壤消毒土壤采用生石灰消毒，80kg～100kg/畝，整地時深翻入土壤20cm，澆透水，一周后可以定植栽培。加強水肥管理移栽前畦面覆蓋地膜，采用膜下滴灌控制水分，保持土壤濕潤，增溫保墑。結合整地，施入適量腐熟好的有機肥作基肥；或每667m2施用商用有機肥400斤、過磷酸鈣30kg、硫酸鉀型復合肥30kg蹲苗結束后，澆一次透水，視辣椒生長情況，隨膜下滴灌追施全營養(yǎng)水溶肥，或高鈣高鉀水溶肥，并交替使用。田間管理辣椒開花前及時摘除門椒及以下側枝，辣椒坐果后及時去除殘留的花瓣，及時疏花疏果、整枝打杈，減少營養(yǎng)消耗，防止產量下降。辣椒成熟后，適時采摘，每次采收應在農藥安全間隔期后進行?；瘜W防治農藥選擇應符合NY/T1276的規(guī)定，農藥使用應符合GB/T8321（所有部分）規(guī)定。藥劑管理按附錄D的農藥管理中要求執(zhí)行。種子消毒播種前，首先是用52℃灌根法辣椒移栽定植成活后，可使用35%甲霜·霜脲氰水分散粒劑400～600倍液，每株灌藥液150mL左右，可間隔7-10d再次施藥，每季可使用3次。噴霧法發(fā)病前或發(fā)病初期，采用噴霧法施藥。噴霧要求均勻周到，每7d～10d噴灑1次，連續(xù)噴2次～3次。主要農藥種類、使用時期、施藥量及施藥方法參考表1。15種防治辣椒疫病的農藥種類及使用序號農藥名稱及劑型使用時期施藥量（畝）150%烯酰嗎啉WP發(fā)病初期35～40g235%烯?！しぐ稴C發(fā)病前或發(fā)病初期60～70mL334%氟啶·嘧菌酯SC發(fā)病前或發(fā)病初期30～35mL4440g/L精甲·百菌清SC發(fā)病前或發(fā)病初期75～165mL550%嘧菌酯WG發(fā)病前或發(fā)病初期20-～36g680%烯酰嗎啉WG發(fā)病初期20～25g770%丙森鋅WP發(fā)病前或發(fā)病初期150～200g872%霜脲·錳鋅WP發(fā)病前或發(fā)病初期140～170g9500g/L氟啶胺SC發(fā)病前或發(fā)病初期25～30mL1075%甲硫·錳鋅WP發(fā)病初期84～120g1120%丁吡嗎啉SC發(fā)病前或發(fā)病初期130～145g1247%烯?！み蜞拙鶶C發(fā)病前60～80mL1370%代森錳鋅WP發(fā)病前或發(fā)病初期175～235g1423.4%雙炔酰菌胺SC發(fā)病前或發(fā)病初期30～40mL1550%錳鋅·氟嗎啉WP發(fā)病初期65～100gWP：可濕性粉劑；SC：懸浮劑；WG：水分散粒劑記錄與檔案應及時詳細做好診斷與防治各環(huán)節(jié)的記錄，并建立檔案，保存完好，作為質量追溯的憑證。檔案保存期限不低于2年。

（資料性附錄）

辣椒疫病病害癥狀圖片辣椒疫病不同發(fā)病部位典型癥狀圖根部癥狀莖部癥狀果實癥狀

（資料性附錄）

病原菌顯微形態(tài)及純化菌落形態(tài)病原菌顯微形態(tài)病原菌菌絲的形態(tài)(顯微鏡10X10倍數(shù))病原菌游動孢子囊梗(顯微鏡10X10倍數(shù))病原菌游動孢子囊(顯微鏡10X10倍數(shù))病原菌純化的菌落形態(tài)病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

（規(guī)范性附錄）

CTAB法提取病原菌基因組DNACTAB法提取基因組DNA具體操作步驟將清洗干凈的研砵，研杵及藥匙滅菌備用，配置好的CTAB提取液置于65℃先加入少量滅菌的石英砂于適量擴繁的病菌菌絲體中迅速研磨后分裝于離心管中，再加入事先預熱的CTAB700μL，反復顛倒震蕩，使其充分混溶，65℃取出冷卻后，加入等體積的苯酚氯仿，輕輕翻轉，混勻后，常溫離心10min(12000rpm)。移取上清液至新離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，輕輕轉動離心管，使DNA沉淀，待白色絮狀沉淀出現(xiàn)后，放置于-20℃棄上清液，吸取適量75％的酒精于離心管中，輕輕搖勻，離心5min（8000rpm），漂洗2次，晾干后，加適量TE緩沖液，4℃用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。PCR反應體系和參數(shù)反應體系ITS4和TIS5引物各加1μL，PCRmix12.5μL，DNA模板1μL，ddH2O9.5μL，無菌水補足至25μL。反應參數(shù)94℃預變性3min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min共35個循環(huán)，72℃PCR產物檢測使用1％的瓊脂糖凝膠，用0.5×TBE電泳緩沖液，100V電泳30～40min；在凝膠成像系統(tǒng)進行電泳結果觀察，判斷是否為預擴增長度的條帶，無非特異性條帶，且濃度大于50ng/μL。交由生物公司純化并測序。PCR產物檢測確定病原菌為辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）,ITS序列片段大小為821bp。M樣品ITS經PCR擴增后產物電泳結果辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）的ITS全序列CGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTCTTGTACCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCCGGGCGAGTAGCTTTTTGTTTTAAACCCATTTCACAATTCTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGTGTTGTCCTTCGGGTCGACTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGGTTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTTAAAGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGCTTATTGAATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTTGGCTTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCATTTTGGGAATTTTGTGTGCACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAGGCAAGATTACCCGCTATA

（規(guī)范性附錄）

農藥管理采購不得采購國家禁止使用的農藥，應從正規(guī)渠