巢式PCR的文檔資料

巢式PCR1.增效PCR（boosterPCR）當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增，消耗了引物和酶，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。對于這種情況，可設置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15～20個循環(huán)后補充引物量，以初級PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，靶序列的產(chǎn)量將相應增加。2.巢式PCR此時也是進行二步PCR，與上面不同的是，第二級PCR需另行設置反應體系，并應用另外的PCR引物，此時引物的位置位于初級PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級PCR產(chǎn)物做模板，進行第二步PCR，這樣只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。巢式PCR：利用兩套PCR引物對進行兩輪PCR擴增反應組成，在第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進行第二輪擴增巢式RT-PCR,這種方法的特點是需要設計兩對引物，一對引物擴增稍長片段，在這一擴增范圍內(nèi)再設計一對引物，擴增的產(chǎn)物是以第一對引物的產(chǎn)物為模版3.RT-PCRRT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴增（達ng～ug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應用于基因表達與調(diào)控的研究。4.基因芯片（又稱DNA芯片，生物芯片，DNA探針微列陣），它集成了大量的密集排列的基因探針，通過與被檢測基因的堿基序列進行互補配對，實雙鏈DNA合成后，利用核酸酶S1切去回折處單鏈DNA，但會使cDNA失去5‘端部分序列。現(xiàn)在較少用RNaseH部分水解雜交鏈中的RNA鏈，但留下一些小片段RNA，作為合成cDNA第二鏈的引物。還需要加入DNA連接酶連接合成片段末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA第一鏈3’端添加一種寡聚寡聚核苷酸尾巴，然后以配對的寡聚物作為引物合成第二鏈6.DNA測序： DNA的序列分析的兩種基本方法：化學法 Maxam-Gilbert酶法 Sanger，雙脫氧終止法 現(xiàn)在全自動測序仍然沿用Sanger氏酶法，但是在標記上作了改進雙脫氧終止法： 雙脫氧核苷酸(ddNTP)的脫氧核糖的3‘位置的-OH缺失。 當它與其他正常核苷酸混合在同一個擴增反應體系中時，在DNA多聚酶的作用下，雖然它也能夠象正常核苷酸一樣參與DNA合成，以其5'位置的磷酸基，與上位脫氧核苷酸的3'位置的-OH結(jié)合，但是，由于它自身3'位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5'磷酸基無法與之結(jié)合過程：設計4種反應體系：都含有正常的4種dNTP（其中一種用同位素標記）單鏈DNA模板（即待測DNA）引物和DNA聚合酶I每組分別各加入一種ddNTP如果是dNTP摻入其中，DNA互補鏈則將繼續(xù)延伸下去；如果是ddNTP摻入其中，DNA互補鏈的合成則到此終止。由于雙脫氧核苷酸的摻入是隨機的，故各個新生DNA片段的長度互不相同通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（能分辨出小至一個堿基長度差的DNA片段），將混合產(chǎn)物中不同長度DNA片段分離開，再通過放射自顯影，根據(jù)片段尾部的雙脫氧核苷酸讀出該DNA的堿基排列順序DNA自動測序：基于Sanger雙脫氧鏈終止法的原理，只不過用四種不同的熒光染料分別標記ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。這四種熒光染料在激