TCRHA 059-2024 基質輔助激光解吸電離飛行時間核酸質譜法體細胞突變檢測通則

ICS11.040.01CCSN54團 體 標 準T/CRHA059—2024基質輔助激光解吸電離飛行時間核酸質譜法體細胞突變檢測通則Generalrulesformatrix-assistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometryfordetectingsomaticmutations2024-07-05發(fā)布 2024-07-10實施中國研究型醫(yī)院學會?發(fā)布T/CRHA059—2024目 次前言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1縮略語 1原理 2試劑與耗材 2儀器與設備 2操作步驟 3樣本的預處理 3核酸提取及要求 3PCR反應 3SAP消化反應 3單堿基延伸反應 3核酸質譜法分析 3性能分析 3準確度 3檢測限 3特異性 3質量控制 4樣品質量控制 4設備質量控制 4軟件質量控制 4過程質量控制 4記錄質量控制 4室間質量評價 4結果分析 4質譜圖分析 4軟件分析 5結果表述 5檢測報告 5檢測結果的描述 5實驗室要求 5實驗室資質 5人員資質和培訓 5IT/CRHA059—2024附錄A（資料性） PCR反應液配方表及反應程序 6附錄B（資料性） SAP反應混合液配方表及反應程序 7附錄C（資料性） 單堿基延伸反應混合液配方表及反應程序 8參考文獻 9IIT/CRHA059—2024前 言本文件按照GB/T1.1—20201草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國研究型醫(yī)院學會臨床數據與樣本資源庫專業(yè)委員會提出。本文件由中國研究型醫(yī)院學會歸口。本文件起草單位：中國人民解放軍總醫(yī)院、浙江迪譜診斷技術有限公司、北京大學腫瘤醫(yī)院、火箭軍特色醫(yī)學中心、迪安診斷技術集團股份有限公司、濟南市中心醫(yī)院。IIIT/CRHA059—2024基質輔助激光解吸電離飛行時間核酸質譜法體細胞突變檢測通則范圍本文件適用于樣本類型包括但不限于新鮮腫瘤組織、腫瘤組織石蠟包埋或者細胞石蠟包埋的切片。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6041-2020質譜分析方法通則GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489-2008實驗室生物安全通用要求T/ZZB2482—2021飛行時間核酸質譜儀術語和定義下列術語和定義適用于本文件。引物primer結合于模板鏈上，引導聚合酶進行延伸的起始位點或終止位點的，具有一定長度和順序的寡核苷酸。聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction一種在體外對模板DNA或RNA的特定片段進行快速擴增的方法包含變性----退火 延伸三個基本反應步驟。單堿基延伸singlebaseextension適宜的反應體系中，在延伸引物引導下，聚合酶以ddNTP或者acyNTP為底物僅延伸單個堿基。注：常用于DNA測序和SNP檢測。體細胞突變somaticmutation相對于胚系突變而言的，發(fā)生在體細胞中的突變，即在體細胞發(fā)生了基因突變或染色體畸變，突變性狀一般不能傳給下一代個體，卻可以引起當代某些細胞的遺傳結構發(fā)生改變的突變。注：本文件的體細胞突變指單堿基突變。縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）1T/CRHA059—2024SAP：蝦堿性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）dUTP：脫氧尿苷三磷酸（2'-deoxyuridine5'-triphosphate）ddATP：2',3'–二脫氧腺苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-adenosine-5'-triphosphate）ddGTP：2',3'-二脫氧鳥苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-guanosine-5'-triphosphate）ddCTP：2',3'-二脫氧胞苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-cytidine-5'-triphosphate）ddTTP：2',3'-二脫氧胸苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-thymidine-5'-triphosphate）UDG：尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNAGlycosylase）原理待檢測樣本中提取純化獲得DNAPCRSAP消化去除擴增產物中多余的dNTP，加入序列特異性延伸引物（其3’端堿基緊挨突變位點）和突變位點特異性DNA樣品中含量低至1%的突變。試劑與耗材除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。本方法中的純化水應符合GB/T6682—2008的二級水。也可根據自身實驗需求，選擇其他型號的同等功能的耗材和試劑。以20μL體系為例，推薦試劑與耗材如下：10xPCR緩沖液；50mmol/L氯化鎂溶液；25mmol/LdNTP/dUTPMix；5U/μLDNA聚合酶；1U/μLUDG；純化水；10×SAP緩沖液；1.7U/μLSAP酶；10x延伸緩沖液；ddATPMix；ddGTPMix；ddCTPMix；ddTTPMix；單堿基延伸引物；延伸酶；質譜芯片。儀器與設備包含但不限于以下設備：超凈工作臺；純水儀；渦旋震蕩儀；高速離心機；掌式離心機；板式離心機；生物安全柜；2T/CRHA059—2024紫外可見分光光度計；PCR擴增儀；飛行時間核酸質譜儀。操作步驟樣本的預處理新鮮組織樣本，根據組織大小剪碎、用玻璃勻漿器將組織徹底研磨。蠟塊樣本，需切成5片4μm厚度的連續(xù)切片，其中1片進行HE染色，確保含有腫瘤病變細胞比例不低于20%，用于核酸提取的需有3張～5張連續(xù)性的切片。核酸提取及要求使用核酸提取試劑盒提取或同類方法；提取的核酸純度通過A260/A280比率判定，DNA的A260/A280的比值建議在1.8～2.0之間。PCR反應PCR反應試劑配制、PCR反應程序參見附錄A。SAP消化反應SAP消化反應步驟如下：BSAP2μL；PCR8.3的擴增產物，放入掌式離心機，5000rpm30s；PCRSAP5μL7μL30s，放入掌式離心機，5000rpm30s；PCRBSAP程序進行消化反應。單堿基延伸反應單堿基延伸反應步驟如下：C配制單堿基延伸反應混合液；PCR8.4SAP產物，放入掌式離心機，5000rpm30s；2μLPCR/SAP30s，放入掌式離心機，5000rpm30s；PCRC的延伸反應程序進行延伸反應。核酸質譜法分析飛行時間質譜儀應符合T/ZZB2482—2021的要求。按照飛行時間核酸質譜儀的操作說明將8.5的延伸產物進行檢測和分析。性能分析準確度選取10（包含弱陽性樣本檢測限經數字PCR5次或進行205次重復檢測，應100%檢出；如果是2019次。特異性3T/CRHA059—2024檢測試劑盒檢測范圍外的其他突變位點的國家參考品或經標化的企業(yè)參考品，檢測結果應為陰性；檢測野生型國家參考品或其他物種的基因組樣本，檢測結果應為陰性或未檢出突變。質量控制樣品質量控制2針～4保存送檢；手術新鮮組織需半個米粒大小，置于組織保存液中，4℃～8℃保存送檢。石蠟/3μm～5μm1cm×1cm10張，腫瘤含20%，蠟卷數量要求同白片。白片需經防脫處理，裝入切1.5ml離心管中密封常溫保存送檢。A260/2801.6～2.0100bp。保存于-80℃冰箱。設備質量控制根據實驗室要求選擇符合要求的設備，設備應定期校準和維護，并按照對頂的使用方法使用。軟件質量控制過程質量控制DNA?？瞻讓φ找话闶褂眉兓Ｙ|控規(guī)則：實驗室應建立適用的質控規(guī)則用來監(jiān)控和分析失控原因。陽性質控品檢出結果應于靶值相同，陰性質控品、空白對照檢出應符合預期，每次質控結果做好質控記錄。記錄質量控制室間質量評價結果分析結果分析應符合GB/T6041-2020的要求。其中：質譜圖分析將對應檢測點不同位置的若干質譜圖合成該檢測點的單一質譜圖；通過基于小波的數字濾波器來消除高頻噪聲和基線；基于質譜圖的擬合曲線，獲得峰高、峰寬、峰面積，質量偏移以及信噪比。4T/CRHA059—2024軟件分析分析軟件應能夠分析每個樣本對應位點質譜峰的峰高、峰面積和信噪比等信息。利用質譜分析軟件，分析陽性對照、陰性對照的檢出情況，陽性對照和陰性對照應滿足預期要求。分析內參的信號峰和突變位點的信號峰，對每個樣本的突變位點進行判斷，按照具體試劑盒陰陽性判斷值的要求進行結果判讀，符合試劑盒陰性要求的判斷為無突變或低于試劑盒檢測要求，符合試劑盒陽性要求的判斷為突變型。結果表述檢測報告樣本檢測報告包含但不限于以下內容：樣本信息：樣本來源信息、樣本唯一性標識、樣本類型、樣本狀態(tài)、采樣日期、送檢日期、以及用于判斷結果所必須的其他信息等；檢測信息：檢測方法、檢測項目、檢測范圍、必要的檢測性能指標、實驗室名稱、實驗室聯(lián)系方式、檢測人員、審核人員、檢測結果對應的解釋或數據資料、樣本接收日期、報告日期等；樣本檢測及結果審核發(fā)布：檢測人員需通過崗位考核并具有初級檢驗技師/士職稱，授權簽字人進行結果審核及發(fā)布；技術局限性：核酸質譜法對體細胞突變檢測是已知位點的定性測試，在定量檢測方面有一定的技術局限性。檢測結果的描述對于腫瘤體細胞突變，基因變異宜按以下分析方式處理。在位點設計階段應考慮已寫入中外診療指南或有明確專家共識的變異位點。對于檢測結果應注明變異位點的來源，明確其藥物及其臨床意義。并根據證據等級分級。處于爭議或臨床意義不明確的基因變異，實驗室應制定統(tǒng)一的標準來應對出現的不明變異。實驗室要求實驗室資質實驗室設計應符合實驗流程，便于操作和使用。實驗室設備應符合相關標準和規(guī)定，確保準確性和安全性。。實驗室環(huán)境應具備適宜的溫濕度控制和照明條件，應具備相應的防護設施，同時應設置相應的環(huán)保設施。GB19489-2008的要求。設置安全出口和消防設施，配備相應的安全設備，同時制定安全管理制度，規(guī)范實驗操作流程，確保實驗室和人員的安全。實驗室廢棄物應分類收集、分類處理，產生的有害廢棄物應按照規(guī)定進行無害化處理，確保環(huán)境安全。a) 人員資質和培訓PCR5T/CRHA059—2024附錄A（資料性）PCR反應液配方表及反應程序PCR反應液配方表見表A.1，PCR反應程序見表A.2。表A.1PCR反應液配方表試劑名稱濃度用量/μLPCR緩沖液10×2.0氯化鎂溶液50mmol/L1.6dNTP/dUTPmix25mmol/L0.1DNA聚合酶5U/μL0.2UDG1U/μL0.2F/R引物10μmol/L0.6純化水/13.4DNA≥5ng/μL2.0總量/20.0表A.2PCR反應程序步驟溫度/℃時間循環(huán)數1372min129510min139520s556530s44∞1注：PCR產物暫時不進行下一步實驗操作，可4℃保存不超過12h。6T/CRHA059—2024附錄B（資料性）SAP反應混合液配方表及反應程序SAP反應混合液配方表見表B.1，SAP反應程序見表B.2。表B.1SAP反應混合液配方表試劑名稱濃度用量/μL10xSAP緩沖液10×0.17SAP1.7U/μL0.3水/1.53總量/2.0表B.2SAP反應程序步驟溫度/℃時間循環(huán)數13740min12855min134∞1注：建議SAP反應產物及時進行下一步實驗操作，若暫不進行下一步操作，可2℃～8℃保存不超過24h。7T/CRHA059—2024附錄C（資料性）單堿基延伸反應混合液配方表及反應程序單堿基延伸反應混合液配方表見表C.1，單堿基延伸反應程序見表C.2。表C.1單堿基延伸反應混合液配方表試劑名稱濃度用量/μL10x延伸緩沖液10×0.2ddATPmix/ddGTPmix/ddCTPmix/ddTTPmix/0.2單堿基延伸引物5μmol/L～15μmol/L0.94延伸酶32U/μL0.04純化水/0.62總量/2.0表C.2單堿基延伸反應程序步驟溫度/℃時間循環(huán)數19530s12955s14