實(shí)驗(yàn)二十二 動(dòng)物寄生蟲病的Dot-ELISA法診斷技術(shù)

實(shí)驗(yàn)二十二動(dòng)物寄生蟲病Dot-ELISA法診斷技術(shù)斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）是在常規(guī)ELISA方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，1982年Hawks等及Herbrind等以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體幾乎同時(shí)建立了Dot-ELISA檢測(cè)法，保留了常規(guī)ELISA特異、敏感、經(jīng)濟(jì)、快速、可自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，而且NC膜具有更好的吸附能力(可100%吸附)，用離子型去污劑裂解的抗原也能很好地吸附，從而使該方法迅速得到推廣，被認(rèn)為是傳染病及寄生蟲病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化最有前途的新技術(shù)之一。以硝酸纖維膜（NC膜）代替聚苯乙烯板，在膜上滴加抗原或抗體，封閉后，按常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)操作，最后用不溶性底物顯色，一般是二氨基鄰笨胺（DAB），其氧化產(chǎn)物為不溶的棕色產(chǎn)物，根據(jù)顯色反應(yīng)有無或顏色深淺，進(jìn)行定性或半定量。斑點(diǎn)ELISA方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，假陽性少；由于NC膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力優(yōu)于聚苯乙烯，故其敏感性比常規(guī)ELISA高6-8倍；試劑用量少，比常規(guī)ELISA至少節(jié)約10倍；抗原膜保存期長(zhǎng)，-20℃可保存半年；檢測(cè)結(jié)果可長(zhǎng)期保存；操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器（酶聯(lián)檢測(cè)儀）。此法簡(jiǎn)易快速，便于推廣，目前已廣泛用于多種寄生蟲病的診斷和監(jiān)測(cè)，如弓形蟲病、包蟲病、囊蟲病、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病、血吸蟲病、華枝睪吸蟲病、旋毛蟲病等抗原或抗體的檢測(cè)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙罅私釪ot-ELISA的原理和基本操作過程。二、實(shí)驗(yàn)器材1．器材。硝酸纖維膜（NC膜）或聚氯乙烯（PVC）白色薄膜凹孔板、微量加樣器、濾紙、玻璃皿等。2．0.01mol/LPBS(pH7.4)。KH2PO40.2gNa2HPO4?12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g蒸餾水加至1000ml3．Tris緩沖液的配制。0.05MTBS(pH7.4)的配制：Tris（三羥甲基胺基甲烷）12.1gNaCl17.5g蒸餾水加至1500ml磁性攪拌下滴加濃HCl至pH為7.4，再加蒸餾水至2000ml。4．封閉液。為2%BSA的0.01mol/LpH7.4的PBS等。5．PBST洗滌液。為0.5%Tween-200.01mol/LpH7.4的PBS。6．底物溶液。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）：0.05%DAB+0.3%H2O2；4-氯-1萘酚：用甲醇配制0.3%母液，4℃保存，用前取1ml母液加0.05mol/LTBS5ml，再加30%H2O210ul。7．酶標(biāo)抗體。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體、酶標(biāo)二抗或辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白（SPA）。三、實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)（一）直接法測(cè)抗原（以檢測(cè)血吸蟲循環(huán)抗原為例）1．原理。將待檢血清點(diǎn)在NC膜上，如血清中含日本血吸蟲循環(huán)抗原則包被在NC膜上形成固相抗原，加入酶抗記的抗血吸蟲單克隆抗體，與固相抗原形成抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，再加入底物，復(fù)合物上的酶則催化底物而顯色，由于每步之間均有沖洗步驟，因此，若樣品中不含有血吸蟲循環(huán)抗原，酶標(biāo)抗體則將被洗掉，底物不顯色而呈陰性反應(yīng)。2．操作方法。具體操作如下：取適當(dāng)大小NC膜，用鉛筆畫或使用點(diǎn)膜器制備直徑5mm的加樣孔，并作好相應(yīng)標(biāo)記。將NC膜浸入到0.01mol/LpH7.4的PBS中15～30min，取出用濾紙吸干。將對(duì)照陽性血清、陰性血清和待檢血清分別點(diǎn)加于加樣孔內(nèi)，室溫干燥。將NC膜浸入封閉液中振搖封閉30min。將NC膜浸入洗滌液中振蕩洗滌3次，每次5min，取出用濾紙吸干。將NC膜浸入單克隆酶標(biāo)抗體溶液中，振搖反應(yīng)30min。重復(fù)步驟5。將NC膜浸入底物溶液中，振搖顯色10～20min。用流水沖洗數(shù)分鐘，放入蒸餾水中終止反應(yīng)。3.判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)顯色反應(yīng)有無或顏色深淺，進(jìn)行定性或半定量：斑點(diǎn)呈深褐紅色為+++，褐紅色為++，淺褐紅色為+，無色為陰性。（二）間接法測(cè)抗體（以檢測(cè)旋毛蟲病抗體為例）1．原理。將特異性抗原點(diǎn)在NC膜上，干燥形成固相抗原，加入待檢血清，如血清中含有抗旋毛蟲特異抗體，則與固相抗原形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的抗抗體（或酶標(biāo)SPA），與上述抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。此時(shí)加入底物，復(fù)合物上的酶則催化底物而顯色（反應(yīng)過程見圖22-1）。由于每步之間均有沖洗步驟。因此，若待檢血清中不含相應(yīng)的抗體，酶標(biāo)抗體將被洗掉，底物不顯色而呈陰性反應(yīng)。固相AgAbAg-Ab結(jié)合物酶標(biāo)抗AbAg-Ab-抗Ab-酶復(fù)合物圖22-圖22-1間接法Dot-ELISA反應(yīng)原理圖2．操作方法。具體操作如下：(1)抗原的制備。收集純凈的濃集旋毛蟲幼蟲，經(jīng)研磨至顯微鏡下觀察不到蟲體碎片，反復(fù)冷浸，離心沉淀，棄去沉渣。再經(jīng)水浴離心后，呈乳白色的上清液即為抗原。使用時(shí)以Tris-HCl緩沖液（pH7.4）進(jìn)行適當(dāng)稀釋。(2)將NC膜浸入到0.01mol/LpH7.4的PBS中15～30min，取出用濾紙吸干。(3)取適當(dāng)大小NC膜，用鉛筆畫或使用點(diǎn)膜器制備直徑5mm的加樣孔，并作好相應(yīng)標(biāo)記。(4)將抗原點(diǎn)加于加樣孔內(nèi)，室溫干燥。(5)將NC膜浸入封閉液中振搖封閉30min。(6)將NC膜浸入洗滌液中振蕩洗滌3次，每次5min，取出用濾紙吸干。(7)將NC膜浸入一定稀釋度的待檢血清中溶液中，同時(shí)做陽性和陰性血清對(duì)照，振搖反應(yīng)30min。(8)重復(fù)步驟6。(9)將NC膜浸入一定稀釋度的酶標(biāo)二抗（或酶標(biāo)SPA）溶液中，振搖反應(yīng)30min。重復(fù)步驟6。將NC膜浸入底物溶液中，振搖顯色10～20min。用流水沖洗數(shù)分鐘，放入蒸餾水中終止反應(yīng)。3.判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)顯色反應(yīng)有無或顏色深淺，進(jìn)行定性或半定量：斑點(diǎn)呈深褐紅色為+++，褐紅色為++，淺褐紅色為+，無色為陰性。（三）白色PVC載體快速Dot-ELISA（以檢測(cè)肺吸蟲抗體為例）1．原理。以聚氯乙烯（PVC）白色薄膜凹孔板代替NC膜為載體進(jìn)行Dot-ELISA，能克服NC試驗(yàn)的一些不足之處，有如下優(yōu)點(diǎn)：待測(cè)血清直接在PCV孔內(nèi)稀釋、試驗(yàn)一次完成，減少血清稀釋及加樣誤差；PVC載體為平底凹孔板，洗滌方便、快速；試劑用量少，試驗(yàn)成本低；試驗(yàn)時(shí)間短。目前已被用于肺吸蟲病、日本血吸蟲病、華枝睪吸蟲病、囊尾蚴病等寄生蟲病的研究。2．操作方法。以檢測(cè)肺吸蟲抗體為例，具體操作如下：（1）抗原的制備。從人工感染衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴的犬肺內(nèi)獲取肺吸蟲成蟲，用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次、凍干、研磨、超聲粉碎、離心，上清液測(cè)定蛋白含量，低溫貯存?zhèn)溆?。?）將抗原點(diǎn)加在孔徑為1cm的白色PVC板孔內(nèi)，室溫干燥。（3）加入封閉液每孔100ul，37℃封閉30min。（4）洗滌。棄孔內(nèi)液體，PBS快洗一次，自來水快洗5次。（5）加一定稀釋度的待檢血清100ul，同時(shí)做陽性和陰性血清對(duì)照，37℃作用10min。（6）重復(fù)步驟4。（7）加適合稀釋度的酶標(biāo)二抗（或酶標(biāo)SPA）溶液100ul，37℃作用10min。（8）重復(fù)步驟4。（9）加底物溶液4ClN-H2O2每孔100ul室溫顯色3～5min。（10）用流水沖洗數(shù)分鐘終止反應(yīng)。3.判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)顯色反應(yīng)有無或顏色深淺，進(jìn)行定性或半定量：陽性孔中心出現(xiàn)淺紫色斑點(diǎn)并與陽性對(duì)照一致，陰性無色或呈現(xiàn)淺灰色環(huán)狀斑點(diǎn)。四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1．包被用的抗原或抗體的蛋白濃度最好是預(yù)先經(jīng)過方陣法滴定選擇其最佳工作濃度。2．可選擇多種封閉液，如2%BSA、0.5%明膠PBST溶液、10%小牛血清、0.5%的脫脂奶粉等。3．實(shí)驗(yàn)時(shí)NC膜可置于玻璃皿、血凝板孔內(nèi)或其它容器里反應(yīng)。4．底物現(xiàn)配現(xiàn)