酵母各種雜交

酵母雜交(zájiāo)技術(shù)2016-7共三十八頁相關(guān)知識：

1、順式作用元件：存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達的序列。包括啟動子、增強子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，作用是參與(cānyù)基因表達的調(diào)控。2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）：能直接或間接地識別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。3、報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。共三十八頁4、cDNA文庫：以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細胞克隆擴增。這些在重組體內(nèi)(tǐnèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。共三十八頁基本原理真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個結(jié)構(gòu)上可以分開(fēnkāi)的、功能上也相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄(zhuǎnlù)激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活因子

BD：識別DNA上特定序列，轉(zhuǎn)錄激活域定位調(diào)控基因的上游。

AD：與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體其他成分作用，從而啟動所調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。共三十八頁

兩個結(jié)構(gòu)域分開時仍具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有他們以適當(dāng)途徑在空間上相互靠近時，才能具有轉(zhuǎn)錄因子活性，激活報告基因的表達。

酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因(jīyīn)通過激活報告基因(jīyīn)的表達，探測蛋白-蛋白的相互作用。酵母雙雜交原理示意圖 X DBD Reportergene Prey Bait AD Y Expression UAS 共三十八頁共三十八頁DNA結(jié)合域（DNA-BD）：N端1-147氨基酸,可識別(shíbié)并結(jié)合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(UAS)。轉(zhuǎn)錄激活域（AD）：C端786-881氨基酸,通過同轉(zhuǎn)錄機制的其它成分之間的結(jié)合以啟動上游激活序列（UAS）下游的基因轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄(zhuǎnlù)因子GAL4結(jié)構(gòu)特點共三十八頁共三十八頁酵母(jiàomǔ)雙雜交步驟1、構(gòu)建質(zhì)粒（誘餌蛋白不發(fā)生自激活）2、轉(zhuǎn)化酵母細胞（本身不表達GAL4）3、陽性(yángxìng)篩選共三十八頁1.（1）BD-plasmid

靶基因(蛋白(dànbái)A基因)按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。篩選標志：TRP（2）AD-plasmid

蛋白(dànbái)B基因按正確閱讀框克隆到GAL4的AD片斷之后。篩選標志：LEU2

共三十八頁（1）雙載體轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)能合成亮氨酸和色氨酸。Trp-Leu-2.兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（HF7c）3.篩選(shāixuǎn)觀察（2）篩選蛋白A和蛋白B能相互作用的雙載體轉(zhuǎn)化子。Trp-Leu-His-共三十八頁酵母(jiàomǔ)細胞cDNA文庫(wénkù)

誘鉺蛋白基因多克隆位點DNA-BD載體AD載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化酵母細胞篩選平板生長菌苔篩選平板生長菌苔同一個三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定β-半乳糖苷酶共三十八頁酵母雙雜交系統(tǒng)(xìtǒng)的應(yīng)用：（1）發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能（2）研究(yánjiū)抗原和抗體的作用（細胞內(nèi)）（3）檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用（4）確定未知蛋白之間的相互作用（5）確定基因治療中多肽類藥物的作用機理共三十八頁應(yīng)用(yìngyòng)舉例《應(yīng)用(yìngyòng)酵母雙雜交篩選與FAM172A相互作用蛋白的研究》實驗步驟：（1）誘餌質(zhì)粒構(gòu)建：①擴增誘餌蛋白基因②與質(zhì)粒載體連接③重組載體鑒定④誘餌蛋白自我轉(zhuǎn)錄激活檢測：將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株，若轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌落表達β-半乳糖苷酶，則可使底物X-Gal變藍，說明存在自激活（假陽性），否則無自激活。共三十八頁（2）人胎腦cDNA質(zhì)粒構(gòu)建(ɡòujiàn)共三十八頁（3）酵母雙雜交篩選人胎腦cDNA文庫①人胎腦cDNA文庫轉(zhuǎn)化誘餌酵母菌及初步篩選:菌液，分別涂布于培養(yǎng)基（A：Leu-/Trp-、B:Leu-/Trp-/His-），A平板上的克隆進行計數(shù)，根據(jù)稀釋度計算轉(zhuǎn)庫效率（轉(zhuǎn)庫效率只有達到(dádào)

1X107-1X108cfu/gDNA以上才能進行文庫的篩選，以保證不會丟失陽性克?、诎肴樘擒彰缚寺∞D(zhuǎn)移濾紙實驗進一步篩選:從B:Leu-/Trp-/His-平板上挑取35個單克隆進行β-半乳糖苷酶克隆轉(zhuǎn)移濾紙實驗，變藍色的為陽性克隆。共三十八頁（3）陽性雜交克隆的質(zhì)粒抽提及一對一驗證:對上述篩選的陽性克隆進行質(zhì)粒抽提，再次進行抗性篩選和質(zhì)粒抽提后，一對一與誘餌質(zhì)粒pGB-FAM172A共轉(zhuǎn)酵母(jiàomǔ)細胞Y190驗證。（4）再次陽性者抽提質(zhì)粒進行測序及生物信息學(xué)分析:利用NCBI對測序所得到的序列進行BLAST比對分析。共三十八頁結(jié)果(jiēguǒ)對10個陽性克隆相應(yīng)的質(zhì)粒進行測序后，通過BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)(duìyìng)6個不同的基因，編碼6種已知的蛋白質(zhì)：RTCD1、MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻獲得了它們的功能信息。其中A2M與糖尿病血管病變密切相關(guān)，也進一步提示FAM172A參與了糖尿病大血管病變的發(fā)病。共三十八頁（1）用體內(nèi)實驗來研究蛋白質(zhì)的相互作用，方法精確，不受外界影響，易于操作;（2）所有操作均在核酸水平進行，無需(wúxū)純化大量的蛋白質(zhì)，可以精確測定蛋白質(zhì)的弱相互作用；（3）運用范圍較大：酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白可以是完整的蛋白質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)的一個功能區(qū)，可以大到一個完整的腫瘤抑制蛋白，也可以小到一個約22個氨基酸的多肽。酵母雙雜交系統(tǒng)(xìtǒng)的優(yōu)點

共三十八頁局限性1、它并非對所有蛋白質(zhì)都適用。

有其原理決定，融合蛋白的相互作用激活報告基因轉(zhuǎn)錄是在細胞核內(nèi)發(fā)生的，而表達的融合蛋白在細胞內(nèi)能否正確折疊并運至核內(nèi)是檢測的前提條件。2、假陽性較多：

某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。如AD融合靶蛋白有DNA的特異

結(jié)合，則可單獨激活報告基因的表達。雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實驗(shíyàn)手段來驗證。共三十八頁局限性

3、陰性干擾：兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。

蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達或不能準確定位到胞核內(nèi)。4、融合蛋白的表達對細胞(xìbāo)有毒性，應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。共三十八頁在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種(sānzhǒnɡ)不同蛋白之間的互作研究。共三十八頁酵母(jiàomǔ)單雜交

酵母單雜交體系是借鑒酵母雙雜交體系的基本原理，通過觀察酵母細胞內(nèi)報告基因的表達(biǎodá)狀況，研究DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。共三十八頁共三十八頁酵母(jiàomǔ)單雜交步驟設(shè)計含目的基因（誘餌）和下游報告基因的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母細胞中。將文庫蛋白的編碼(biānmǎ)基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入同一酵母細胞中。若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達將其篩選。共三十八頁共三十八頁單雜交(zájiāo)優(yōu)點實驗過程簡單，耗時短：能直接識別并找出與特異順式作用元件相結(jié)合的蛋白(dànbái)質(zhì)及其編碼序列，而不需通過制備純化蛋白(dànbái)或抗體等繁瑣的生化手段來建立這種相互作用關(guān)系；酵母屬于真核生物，且蛋白質(zhì)處于自然構(gòu)象，避免了體外研究的不足。共三十八頁單雜交(zájiāo)局限性與內(nèi)源性的表達激活因子發(fā)生相互作用；假陽性：插入的靶元件有可能不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以直接激活報道基因的表達；假陰性：融合蛋白有毒性、不能穩(wěn)定(wěndìng)地表達，錯誤折疊不能準確定位于酵母細胞核內(nèi)、DNA結(jié)合位點被封閉；酵母細胞內(nèi)蛋白修飾缺乏；共三十八頁TF:介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的第三種因子(yīnzǐ)，

可以是蛋白質(zhì),DNA,RNA或小分子配體。兩個蛋白之間通過第三者發(fā)生(fāshēng)相互作用，用來檢測蛋白質(zhì)與RNA、蛋白、小分子配體間相互作用酵母三雜交技術(shù)共三十八頁應(yīng)用(yìngyòng)1、研究(yánjiū)RNA-蛋白質(zhì)間相互作用共三十八頁應(yīng)用(yìngyòng)2、研究(yánjiū)小分子受體與蛋白質(zhì)受體間相互作用共三十八頁

在該系統(tǒng)(xìtǒng)中,第三個雜交小分子為Dex(地塞米松)-FK506偶聯(lián)體,利用已知的地賽米松受體和FK506受體FKBP12分別構(gòu)建AD和BD融合蛋白,三種分子相互作用后,成功的激活了報道基因的表達;而當(dāng)單體FK506分子引入時,由于競爭性結(jié)合FKBP12,導(dǎo)致三元復(fù)合物無法形成,幾乎完全抑制了報道基因的表達。舉例(jǔlì)共三十八頁3、研究(yánjiū)復(fù)雜的蛋白-蛋白間相互作用應(yīng)用(yìngyòng)共三十八頁不能用來研究位于細胞核外的RNA分子；許多蛋白質(zhì)需要輔因子作用使其結(jié)合到它們的對應(yīng)的RNA上，然而這些輔因子可能(kěnéng)定位于細胞的其他區(qū)域不能在核中發(fā)揮作用（假陰性）;不適用經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾才能與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA分子三雜交(zájiāo)局限性共三十八頁細胞內(nèi)進行核酸水平操作(cāozuò)簡單三者優(yōu)點(yōudiǎn)共三十八頁假陽性假陰性對核外分子無用對需要進行復(fù)雜(fùzá)轉(zhuǎn)錄后修飾的分子無用三者局限(júxiàn)共三十八頁謝