蛋白質(zhì)分析的意義培訓(xùn)講學(xué)

蛋白質(zhì)分析的意義基礎(chǔ)科學(xué)研究這主要是生命科學(xué)研究向分析學(xué)家提出的課題。在生命科學(xué)研究中，人們需要了解各種蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，蛋白質(zhì)的存在形態(tài)以及與小分子，甚至金屬離子的相互作用等等。食品的鑒定與評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)是生物體的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是食品的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。測(cè)定食品店品中蛋白質(zhì)的含量對(duì)指導(dǎo)食品的加工工藝的改革、優(yōu)化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意義。評(píng)價(jià)健康、診斷疾病人體內(nèi)的酸堿平衡，電解質(zhì)平衡，遺傳信息的傳遞，物質(zhì)的代謝和運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!蛋白質(zhì)的分析方法

一類是利用蛋白質(zhì)的共性，如含氮，含肽鍵和折射率等性質(zhì)測(cè)量蛋白質(zhì)的含量；二是利用蛋白質(zhì)中某些特定的氨基酸殘基、芳香基團(tuán)、酸性和堿性基團(tuán)等測(cè)量蛋白質(zhì)的含量。

我們熟悉的克氏定氮法是第一類分析方法中的一種，而本文要介紹的等電聚焦法屬第二類分析方法。克氏定氮法分析蛋白質(zhì)只可通過(guò)測(cè)定待測(cè)物的總含氮量進(jìn)而推出蛋白質(zhì)含量，不能分析出所含蛋白質(zhì)種類及各類含量而電泳法正好彌補(bǔ)了這個(gè)不足。分析意義分析方法

等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!回顧一下等電點(diǎn)的有關(guān)知識(shí)設(shè)HA為一兩性物質(zhì)，處于等電點(diǎn)時(shí)x(H2A+)=x(A-),即所以，pH=1/2(pKa1+pKa2)=pI(等電點(diǎn))氨基酸的等電點(diǎn)計(jì)算可以參照上述公式。分析意義分析方法等電點(diǎn)

原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!電泳的原理

溶液中任何物質(zhì)由于其中本身的解離或表面吸附其他帶電質(zhì)點(diǎn)而帶電，帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)，移動(dòng)方向取決于它們的帶電符號(hào)。電泳技術(shù)就是由各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移率不同而進(jìn)行分離的一種技術(shù)。生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，帶電的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中會(huì)朝著與自己所帶電荷相反方向移動(dòng)，根據(jù)各種蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度不同，對(duì)各種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!在電場(chǎng)中，速度通常用泳動(dòng)度來(lái)表示。泳動(dòng)度是帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。即：

U=v/E=(d/t)/(V/L)=(d/V)*(L/t)

式中u---------泳動(dòng)度，cm2/(V.s)V---------泳動(dòng)速度，cm/sE--------電場(chǎng)強(qiáng)度,V/cmd-------顆粒泳動(dòng)距離，cmL------支持物有效長(zhǎng)度，cmV------實(shí)際電壓，Vt-----通電時(shí)間，s

通過(guò)測(cè)量d,L,V,t,即可計(jì)算出顆粒的泳動(dòng)度，而當(dāng)外界因素一定，泳動(dòng)度是一物質(zhì)的特性，通過(guò)測(cè)泳動(dòng)度，可以鑒別待測(cè)物。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的基本原理1．分離成為可能：由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，因而有不同的等電點(diǎn)。當(dāng)pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場(chǎng)的作用下向陽(yáng)花負(fù)極移動(dòng)；當(dāng)pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為0，在電場(chǎng)的作用下不發(fā)生移動(dòng)，當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)；不同蛋白質(zhì)的搭配組成差別很大，因此蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍很寬。等電聚焦電泳技術(shù)就是在電泳支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在正負(fù)極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中受電場(chǎng)力作用而泳動(dòng)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子一旦到達(dá)它的等電點(diǎn)位置，分子所帶凈電荷為0，就不能再遷移。因此蛋白質(zhì)在與其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而穩(wěn)定的區(qū)帶。這種效應(yīng)稱之為“聚焦效應(yīng)”，保證了蛋白質(zhì)分離的高分辨率，是等電聚焦最為突出的優(yōu)點(diǎn)。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!2．等電聚焦中pH梯度的形成：

pH梯度的形成依靠有緩沖作用的兩性載體電解質(zhì)，載體電解質(zhì)是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5到10之間，載體兩性電解質(zhì)溶液的pH大約是該溶液pH范圍的平均值。在沒(méi)有電流時(shí)，所有載體兩性分子都帶電荷，所帶總的凈電荷為0。第一步：未通電時(shí)，帶電分子無(wú)序排列分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!第二步：通過(guò)后最先在正極和負(fù)極形成pH梯度第三步：穩(wěn)定的pH梯度形成分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!

根據(jù)兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，在泳動(dòng)過(guò)程中不斷地與溶液交換質(zhì)子，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即兩性電解質(zhì)得失質(zhì)子相等，不再出現(xiàn)質(zhì)子交換，載體兩性電解質(zhì)至達(dá)等電點(diǎn)并停留在自己的pI區(qū)域，pI即是此處的pH值，于是載體電解質(zhì)分離為連續(xù)pH不同的條帶，從而形成連續(xù)的多個(gè)pH緩沖區(qū)。由于凝膠的防對(duì)流作用，可使pH梯度保持穩(wěn)定不變。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!

3蛋白質(zhì)分子分離了如果把蛋白質(zhì)溶液與載體兩性電解質(zhì)混合，隨時(shí)著pH梯度的形成，蛋白質(zhì)也將在自己的pI處沉淀下來(lái)。這樣蛋白質(zhì)就被分離開(kāi)了。再經(jīng)過(guò)后續(xù)處理，就可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!4．載體兩性物質(zhì)的選擇作為好的兩性電解質(zhì)載體必需符合下列要求:(1).有足夠的緩沖能力，以便能形成pH梯度，而不受蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的影響。(2).在等電點(diǎn)處必需有足夠的電導(dǎo)，以便使一定的電流通過(guò)。而且要求各不同pI的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，使整個(gè)體系中的電導(dǎo)均勻。(3).相對(duì)分子質(zhì)量要小，以便與被分離的高分子物質(zhì)用分子篩或透析法分開(kāi)。(4).化學(xué)組分不同于被分離物質(zhì)，以免干擾測(cè)定。(5).不與被分離物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)，也不會(huì)引起被分離物質(zhì)變化。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!5．支持pH梯度的介質(zhì)選擇等電點(diǎn)聚焦電泳的主要條件之一是具有穩(wěn)的pH梯度，以防上對(duì)流，避免已分離的物質(zhì)再度混合。支持pH梯度的介質(zhì)有如下兩類(1)密度梯度溶液密度梯度溶液由一個(gè)重溶液和一個(gè)輕溶液在梯度混合器中混合而成。最常用的密度梯度溶質(zhì)是蔗糖，因?yàn)樗鼘?duì)蛋白質(zhì)無(wú)害且有保護(hù)作用。輕液一般用水。(2)凝膠等電點(diǎn)聚焦廣泛使用凝膠作為支持pH梯度的介質(zhì)。應(yīng)用最多的是聚丙烯酰胺凝膠。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!等電點(diǎn)聚焦的顯著優(yōu)點(diǎn)1.分辨率高2.很稀的樣品都可分離，且重現(xiàn)性好3.可用于測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽的等電點(diǎn)分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!等電點(diǎn)聚焦的缺點(diǎn)1.要求使用無(wú)鹽溶液，而某些蛋白質(zhì)在無(wú)鹽溶液中溶解度低，可能產(chǎn)生沉淀；2.樣品中各組分都聚焦到其等電點(diǎn)，對(duì)一些在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)不適用。分析意義分析方法等電點(diǎn)原理一原理二首頁(yè)參考文獻(xiàn)再見(jiàn)了!參考文獻(xiàn)：郭勇《現(xiàn)代生化技術(shù)》科學(xué)出版社周先碗于曉倩《生物化學(xué)儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)》化學(xué)工業(yè)出版社李元宗常文