葡萄糖氧化酶在單胃動(dòng)物減抗中的應(yīng)用及制劑工藝改進(jìn)初探

葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，E.C.1.1.3.4，GOD），又稱為β-D-葡萄糖氧化還原酶，是用金黃色青霉菌進(jìn)行深層通風(fēng)發(fā)酵，精制而得。用點(diǎn)青霉和黑曲霉也可以制得。葡萄糖氧化酶廣泛用于葡萄酒、啤酒、果汁等食品脫氧、面粉改良、防止食品褐變等方面，在食品快速檢測(cè)及生物傳感器上也廣泛應(yīng)用。由于微生物生長(zhǎng)繁殖快、來源廣，是生產(chǎn)GOD的主要來源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。1GOD的抗氧化作用機(jī)制GOD在有氧條件下能專一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，消耗分子氧或原子氧氧化葡萄糖，保護(hù)食品中的易氧化成分。按反應(yīng)條件GOD催化反應(yīng)有3種形式；（1）沒有過氧化氫酶存在時(shí)，每氧化1mol葡萄糖消耗1mol氧；（2）有過氧化氫酶存在時(shí)，每氧化1mol葡萄糖消耗1/2mol氧；（3）有乙醇及過氧化氫酶存在時(shí)，過氧化氫酶可用于乙醇的氧化，每氧化1mol葡萄糖消耗1mol氧；GOD對(duì)β-D-葡萄糖表現(xiàn)出強(qiáng)烈的特異性，葡萄糖分子C(1)上的羥基對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要，且羥基處于β位時(shí)的活性要比在α位時(shí)高約160倍。葡萄糖氧化酶對(duì)L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡糖則完全沒有活性。2GOD的酶學(xué)性質(zhì)高純度GOD為淡黃色晶體，易溶于水，可制成液體制劑。GOD完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機(jī)溶劑。GOD相對(duì)分子質(zhì)量在1.5×105左右，含2分子黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。pH作用范圍3.5～6.5，最適pH5.0左右，在沒有保護(hù)劑存在的條件下pH＞8.0或pH＜3.0時(shí)會(huì)迅速失活。GOD的作用溫度范圍為30～60℃。固體酶制劑在0℃下至少可保存2年，-15℃下可保存8年。3葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)動(dòng)物的有益作用3.1清除分子氧應(yīng)用于動(dòng)物時(shí)酶（GOD）的催化作用是使消化道內(nèi)分子氧減少，有利于腸道厭氧環(huán)境的維持，促進(jìn)厭氧有益菌的生長(zhǎng)。3.2酸化作用胃腸道的pH會(huì)影響蛋白酶原轉(zhuǎn)化為蛋白酶的過程及消化酶的活性，進(jìn)而影響飼糧的消化率。葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖生成的產(chǎn)物葡萄糖醛酸（GA）是一種有機(jī)弱酸，可作為益生元改變腸道菌群，其經(jīng)微生物繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（SCFA）可以進(jìn)一步降低腸道pH；葡萄糖醛酸（GA）在體外系統(tǒng)中可調(diào)節(jié)盲腸菌群，增加SCFA的產(chǎn)生，降低氨的濃度。3.3體外試驗(yàn)證明葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)多種致病細(xì)菌、真菌都有抑菌作用。且對(duì)一些植物病原菌引起的植物病害也有預(yù)防和治療效果。該抑菌原理主要是依靠催化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫完成，通過引起細(xì)胞質(zhì)過氧化、干擾細(xì)胞內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)、破壞蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或損傷遺傳物質(zhì)等方式影響細(xì)菌和真菌的正常生理功能。3.4葡萄糖氧化酶（GOD）在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果3.4.1改善生產(chǎn)性能在斷奶仔豬、哺乳母豬、肉雞、肉鴨日糧中添加60～200U/kg的葡萄糖氧化酶（GOD）可以提高動(dòng)物的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）,料重比（F/G）進(jìn)而提高整體的飼料轉(zhuǎn)化率。同時(shí)改善肉禽肉質(zhì)。3.4.2改善繁殖性能李嘉輝等研究表明產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼料添加350～500mg/kg葡萄糖氧化酶（GOD）后，產(chǎn)蛋率、種蛋蛋殼厚度和哈氏單位顯著增加，料蛋比顯著降低；孫穎雪、Sun等研究表明葡萄糖氧化酶（GOD）可以提高妊娠母豬后期平均采食量（ADFI）以及斷奶7d發(fā)情率，降低母豬泌乳期背膘損失，并顯著提高斷奶時(shí)仔豬窩重。3.4.3改善機(jī)體免疫水平飼料中添加適宜劑量的葡萄糖氧化酶（GOD）可以改變動(dòng)物的免疫器官指數(shù)、血或腸道中細(xì)胞因子（IFN-α、γ干擾素、IL-2白細(xì)胞介素）和抗體的含量或表達(dá)水平，由此改善機(jī)體的免疫水平。3.4.4改善腸道健康葡萄糖氧化酶（GOD）可以改善腸道屏障功能，促進(jìn)受損的腸絨毛修復(fù)，進(jìn)而改善腸道形態(tài)；通過產(chǎn)生厭氧環(huán)境抑制有害菌繁殖，維持腸道菌群平衡。添加葡萄糖氧化酶（GOD）還可以改善動(dòng)物抗氧化能力，緩解熱應(yīng)激、緩解動(dòng)物霉菌毒素中毒；陳成等的研究表明斷奶仔豬飼料中添加30mg/kg活性為1000U/g的葡萄糖氧化酶（GOD）可以替代3000mg/kg氧化鋅，經(jīng)濟(jì)效益顯著，且完全避免了鋅對(duì)環(huán)境的污染。盡管葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)動(dòng)物具有以上諸多的有益效果，但酶活性在沒有保護(hù)劑存在的條件下，pH＞8.0或pH＜3.0時(shí)會(huì)迅速失活。而單胃動(dòng)物如體重30kg以上的育肥豬、成年母豬、2月齡以上的肉雞、肉鴨，產(chǎn)蛋雞等多種畜禽的胃液pH值均在3以下。其中成年豬胃液pH值大多在1～2，2月齡以上肉禽、蛋雞肌胃胃液pH值大多在1.5～3，當(dāng)葡萄糖氧化酶（GOD）通過該段消化道時(shí)酶活性會(huì)顯著降低（30%～100%）甚至完全失活，且不可逆。進(jìn)而限制了葡萄糖氧化酶（GOD）上述動(dòng)物養(yǎng)殖中的使用。4葡萄糖氧化酶制劑工藝改進(jìn)鑒于葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的限制，在單胃動(dòng)物（特別是成年豬、禽）的日常應(yīng)用受到局限。為了提高葡萄糖氧化酶在上述動(dòng)物養(yǎng)殖中的使用效果，通過對(duì)葡萄糖氧化酶進(jìn)行腸溶包衣，制作出對(duì)動(dòng)物pH＜3.0胃液完全穩(wěn)定的腸溶型葡萄糖氧化酶微囊或腸溶固體分散體，以完全保護(hù)葡萄糖氧化酶的酶活性。該制劑工藝中通過在葡萄糖氧化酶中添加pH5～5.5的酸堿緩沖體系，為葡萄糖氧化酶在動(dòng)物腸道中發(fā)揮最大效能提供最優(yōu)pH環(huán)境。制劑工藝主要解決了以下三個(gè)方面的技術(shù)問題：4.1通過在葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）中添加pH5～5.5的酸堿緩沖體系，制作出在動(dòng)物不同腸道中出穩(wěn)定酸堿環(huán)境，可以發(fā)揮最大酶催化功效囊芯材料。4.2對(duì)葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）囊芯材料進(jìn)行腸溶包衣，制成腸溶微囊，完全消除動(dòng)物胃液低pH環(huán)境（pH＜3.0）對(duì)葡萄糖氧化酶酶催化活性的影響甚至滅活效應(yīng)。4.3通過對(duì)包衣材料崩解條件的控制和動(dòng)物不同腸道內(nèi)環(huán)境pH值相適應(yīng)，制作出在動(dòng)物十二指腸崩解葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）微囊，將葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）酶促氧化效能發(fā)揮到最大程度。5技術(shù)方案5.1腸溶微囊制劑工藝5.1.1pH5～5.5的酸堿緩沖體系的葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4，GOD）囊芯構(gòu)造5.1.1.1囊芯材料及配比材料：葡萄糖氧化酶，食品級(jí)；12水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），檸檬酸（C6H8O7）、化學(xué)純；可溶性淀粉，食品級(jí)。按工藝要求比例進(jìn)行芯材材料配比。因均具有吸濕性，需干燥密封保存。5.1.1.2芯材處理工藝要求生產(chǎn)環(huán)境相對(duì)濕度應(yīng)控制40%以下，保持通用環(huán)境溫度（20～25℃）；未包被芯材必須干燥密封保存。（1）緩沖體系預(yù)混合緩沖體系磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）：檸檬酸（C6H8O7）按6.8:2的比例在密閉容器內(nèi)進(jìn)行充分預(yù)混合。（2）芯材預(yù)混合將葡萄糖氧化酶：緩沖體系預(yù)混合物：可溶性淀粉按100:8.8：12的比例在密閉容器內(nèi)進(jìn)行充分預(yù)混合。（3）使用干法壓片制粒機(jī)，對(duì)上述芯材進(jìn)行反復(fù)壓片篩選制粒，顆粒大小控制在50～2000μm以內(nèi)。5.1.2芯材顆粒腸溶包衣工藝5.1.2.1腸溶包衣材料及配比腸溶包衣材料包括：蟲膠，鄰苯二甲酸醋酸纖維素，硬脂酸鎂，均為化學(xué)純；聚乙二醇6000；丙酮，無水乙醇，化學(xué)純；按工藝要求，在要求的生產(chǎn)環(huán)境中對(duì)腸溶包衣材料按配比標(biāo)準(zhǔn)分別稱重配比、備用。5.1.2.2腸溶包衣材料預(yù)處理先將丙酮、無水乙醇制成混合溶液，并攪拌均勻；順序加入蟲膠2.3份，鄰苯二甲酸醋酸纖維素6份，攪拌70-90min，完全溶解后依次加入硬脂酸鎂0.2份，聚乙二醇60001.5份，攪拌溶解后備用。5.1.2.3芯材包衣，包衣工藝將待包衣的芯材顆粒置入密封流化床中，通入氣流使芯材顆粒流化，將腸溶包衣材料混合溶液輸入流化床并霧化，使芯材顆粒表面粘附一層包衣材料，過濾回收系統(tǒng)持續(xù)抽走氣化的溶液溶劑，并通過冷凝液化系統(tǒng)回收混合溶液以持續(xù)使用。如法包衣若干層，至達(dá)到規(guī)定要求為止。腸溶微囊成品要求：（1）囊芯材料腸溶包衣后增重控制在3.5%以內(nèi)；（2）腸溶包衣完全，成品腸溶微囊流動(dòng)性好；（3）腸溶微囊在pH＜2.0鹽酸溶液檢查2h，不得裂縫崩解或軟化，于pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中1h內(nèi)應(yīng)全部崩解；（4）檢查腸溶微囊崩解后酶活性不得低于包衣前的95%。5.2葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）固體分散體構(gòu)造5.2.1固體分散體材料及配比：5.2.1.1噴涂藥物材料準(zhǔn)備：葡萄糖氧化酶，、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、蟲膠，化學(xué)純；硬脂酸鎂、聚乙二醇6000丙酮、無水乙醇，化學(xué)純；5.2.1.2材料配比：蟲膠2.4份，鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素6份，硬脂酸鎂0.1份，聚乙二醇60001.5份，丙酮50份，無水乙醇60份比例進(jìn)行材料配比。因均具有吸濕性，需干燥密封保存。5.2.2固體分散體處理工藝固體分散體芯材載體為麥飯石或玉米芯（粒徑100～1000um）必須干燥密封保存。5.2.2.1在工藝要求生產(chǎn)環(huán)境中將上述材料按配比標(biāo)準(zhǔn)分別稱重備用。5.2.2.2固體分散體藥物噴涂體系預(yù)混合先將丙酮、無水乙醇制成混合溶液，并攪拌均勻；順序加入蟲膠、鄰苯二甲酸醋酸纖維素，攪拌70～90min，完全溶解后依次加入硬脂酸鎂0.1份，聚乙二醇60001.5份，攪拌溶解后備用。5.2.2.3將葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）攪拌均勻分散到腸溶分散體系的有機(jī)溶劑溶液中5.2.2.4固體分散體噴涂工藝將待噴涂的芯材載體麥飯石或玉米芯顆粒置入密封流化床中，通入氣流使載體芯材顆粒流化，將葡萄糖氧化酶（GOD）腸溶有機(jī)溶劑混合溶液輸入流化床并霧化，使固體載體顆粒表面粘附一層腸溶有機(jī)溶劑混合溶液，過濾回收系統(tǒng)持續(xù)抽走氣化的溶液溶劑（丙酮、無水乙醇），而使顆粒表面不斷干燥，并通過冷凝液化系統(tǒng)回收混合溶液以持續(xù)使用。如法噴涂若干層，至達(dá)到規(guī)定要求為止。5.2.2.5葡萄糖氧化酶（GOD）腸溶固體分散體成品制劑要求：（1）載體材料腸溶噴涂包衣后增重控制在20～25%；（2）葡萄糖氧化酶（GOD）腸溶混合溶液噴涂完全，固體分散體成品流動(dòng)性好；（3）腸溶固體分散體在pH＜2.0鹽酸溶液檢查2h，不得裂縫崩解或軟化，于pH為6.8的磷酸鹽緩沖液中1h內(nèi)應(yīng)全部崩解溶出。（4）檢查固體分散體崩解后酶活性不得低于加工前的95%。6葡萄糖氧化酶腸溶微囊及固體分散體包衣結(jié)構(gòu)示意圖（見圖1和圖2）圖1（1葡萄糖氧化酶；2pH緩沖體系；3可溶性淀粉；4囊芯顆粒；5腸溶包衣材料）圖2（1葡萄糖氧化酶；2固體分散體載體；3固體分散體腸溶藥物表層噴涂物）7葡萄糖氧化酶腸溶制劑工藝達(dá)到的效果7.1腸溶微囊和固體分散體借助腸溶包衣的保護(hù)，克服動(dòng)物（豬、禽）胃液（