中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則課件

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(1中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢查

指導(dǎo)原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(2我國(guó)微生物檢查發(fā)展概況抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(3我國(guó)微生物檢查發(fā)展概況中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(4

我國(guó)開展藥品無菌檢查和微生物限度檢查已有數(shù)十年的歷史。新中國(guó)第一部藥典（1953年版）收載了無菌檢查法，以后每部進(jìn)行了不斷的修訂和完善，從樣品的取樣量到培養(yǎng)時(shí)間的變化都更加的科學(xué)，合理。我國(guó)藥品微生物限度檢查起步較晚，始于1972年。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(5

1972年我國(guó)開展藥品微生物污染檢查工作，經(jīng)幾年的調(diào)查研究，1978衛(wèi)生、化工、商業(yè)三部聯(lián)合頒發(fā)了我國(guó)第一個(gè)“藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”。該標(biāo)準(zhǔn)主要為中藥、化學(xué)藥，按丸、片、散、沖及糖漿、合劑、水劑等劑型規(guī)定了微生物限度。包括細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)；口服藥品1g或1ml不得檢出大腸埃希菌、沙門菌，外用藥品1g或1ml不得檢出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌；口服藥品不得檢出活螨。

1980年版《藥品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》中收載了破傷風(fēng)梭菌檢查法，并對(duì)用于深部組織、創(chuàng)傷、潰瘍及陰道用藥開始檢查破傷風(fēng)梭菌。至此形成了我國(guó)藥品微生物限度檢查法及限度標(biāo)準(zhǔn)的基本框架。

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中國(guó)藥典1990年版第二增補(bǔ)本收栽20個(gè)化學(xué)藥品種的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。中國(guó)藥典1995年版收載了微生物限度檢查法，對(duì)少數(shù)劑型收載了微生物限度。按劑型制訂微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，是根據(jù)我國(guó)國(guó)情決定的。從發(fā)展看，以品種來制定標(biāo)準(zhǔn)較為合理。由于新劑型層出不窮，按劑型制訂微生物限度標(biāo)準(zhǔn)十分復(fù)雜，中國(guó)藥典2005年版開始根據(jù)用藥途徑制訂藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，無論化學(xué)藥或中藥制劑的微生物限度，都有大的變動(dòng)，同時(shí)對(duì)含藥材原粉和含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑增訂了檢查大腸菌群及含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑還增訂了細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。2005版藥典在無菌和微生物限度檢查法中首次明確了方法驗(yàn)證的概念。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(7

2010版藥典起草的指導(dǎo)思想一、以科學(xué)發(fā)展觀為統(tǒng)領(lǐng)，服務(wù)于資源節(jié)約型社會(huì)、環(huán)境友好型社會(huì)的要求；落實(shí)科學(xué)監(jiān)管理念，著力解決發(fā)展中的問題。二、與時(shí)俱進(jìn)，廣泛吸納先進(jìn)技術(shù)與成果；堅(jiān)持自主與創(chuàng)新；積極推進(jìn)藥品標(biāo)準(zhǔn)化戰(zhàn)略，提高我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)總體水平，著力提升《中國(guó)藥典》在國(guó)際社會(huì)中的地位和作用，提高綜合競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，為構(gòu)建社會(huì)主義和諧社會(huì)作出貢獻(xiàn)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(8

2010版藥典起草的基本原則一、堅(jiān)持保障藥品質(zhì)量、維護(hù)人民健康的原則二、堅(jiān)持繼承、發(fā)展、創(chuàng)新的原則三、堅(jiān)持科學(xué)、實(shí)用、規(guī)范的原則四、堅(jiān)持質(zhì)量可控性原則五、堅(jiān)持標(biāo)準(zhǔn)先進(jìn)性原則六、堅(jiān)持標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展的國(guó)際化原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(9

2010版藥典在2005版的基礎(chǔ)上增訂了白色念珠菌的檢查，規(guī)定眼用制劑按無菌制劑要求，明確用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用劑型均按無菌要求。中藥橡膠膏劑首次提出不得檢出致病菌檢查要求。新增抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則、藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則、微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則、藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則等，以縮小附錄在微生物檢查方面與國(guó)外藥典的差距。

2010版中國(guó)藥典，我國(guó)藥品無菌、微生物限度檢查方法和標(biāo)準(zhǔn)在科學(xué)性、合理性以及與國(guó)際接軌方面均有了長(zhǎng)足進(jìn)展，使我國(guó)藥品無菌和微生物限度檢查步入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(10抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(11

如果藥物本身無足夠的抗菌力，在正常儲(chǔ)存和使用過程中（尤其是多劑量制劑）可能發(fā)生微生物污染和大量繁殖，對(duì)患者造成感染或引起藥物變質(zhì)。最近我國(guó)白內(nèi)障病人感染銅綠假單胞菌事件，以及目前國(guó)外尚在調(diào)查的博士倫護(hù)理液的問題，足以提醒我們此類制劑微生物污染的嚴(yán)重后果。在生產(chǎn)過程中添加適合的抑菌劑可以保證藥品在正常儲(chǔ)存和使用過程中的質(zhì)量。目前歐洲、美國(guó)、英國(guó)等國(guó)藥典均已在附錄中收載了抑菌劑效力測(cè)定，我國(guó)2010版藥典增訂抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則，目的在于縮短與歐美國(guó)家的距離，評(píng)價(jià)最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時(shí)也可用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑的確定。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(12

所有抑菌劑都具有一定的毒性，而且在貯存過程中其有效性有可能因藥物的活性成分提高或降低，為保證藥品的質(zhì)量和用藥安全，添加抑菌劑的量應(yīng)根據(jù)制劑本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。抑菌劑效力的測(cè)定可為生產(chǎn)過程中添加抑菌劑提供指導(dǎo)，隨著科學(xué)發(fā)展，新型抑菌劑大量出現(xiàn)，抑菌劑效力的測(cè)定更為重要；使生產(chǎn)者正確掌握產(chǎn)品中添加抑菌劑的效力，有助于選擇合適的抑菌劑，也可對(duì)抑菌劑使用的正確性給予評(píng)價(jià)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(13

抑菌劑效力檢查法系用于測(cè)定滅菌、非滅菌制劑中抑菌劑的活性，以評(píng)價(jià)最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時(shí)也可用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑的確定。如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性（如水溶液制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏和使用過程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖使藥物發(fā)生變質(zhì)而對(duì)使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。在藥品生產(chǎn)過程中，抑菌劑不能用于替代藥品生產(chǎn)的GMP管理，不能作為非滅菌制劑降低微生物污染的唯一途徑，也不能作為控制多劑量包裝制劑滅菌前的生物負(fù)載的手段。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(14

所有抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量。同時(shí)，為保證用藥安全，最終包裝容器中的抑菌劑有效濃度應(yīng)低于對(duì)人體有害的濃度并在藥品包裝上注明添加抑菌劑的名稱和數(shù)量。在制劑通則中要求具有抗菌活性的制劑，不管是添加的抑菌劑，還是藥物本身具有抗菌活性，在藥物研發(fā)階段，均應(yīng)確認(rèn)其抗菌效力。抑菌劑的抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而提高或降低，因此，應(yīng)驗(yàn)證最終容器中的抑菌劑效力在效期內(nèi)不因貯藏條件而降低。本試驗(yàn)方法和抑菌劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)用于包裝未啟開的成品制劑。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(15

抑菌劑效力測(cè)定實(shí)驗(yàn)

1.培養(yǎng)基：胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。用于抑菌劑效力測(cè)定的培養(yǎng)基必須通過適用性檢查。測(cè)定細(xì)菌用胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，測(cè)定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

2.菌種：同培養(yǎng)基適用性檢查，若需要，制劑中常見的污染微生物也可作為試驗(yàn)菌株。制備成濃菌液（108cfu/ml）。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(163.供試品接種：為了達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康模鶕?jù)供試品的給藥途徑和用途將供試品分為四類，以便標(biāo)準(zhǔn)的制定和執(zhí)行。

1類注射劑、其他非腸道制劑，包括乳劑、耳用制劑、無菌鼻用制劑及眼用制劑

2類局部給藥制劑、非滅菌鼻用制劑及用于黏膜的乳劑

3類口服非固體制劑（非抗酸制劑）

4類非固體抗酸制劑中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(17

抑菌劑效力可能受試驗(yàn)用容器特征的影響，如容器的材質(zhì)、形狀、體積及封口的方式等。因此，只要供試品每個(gè)包裝容器的裝量足夠試驗(yàn)用，同時(shí)容器便于按無菌操作接入試驗(yàn)菌液、混合及取樣等，一般應(yīng)將試驗(yàn)菌直接接種于供試品原包裝容器中進(jìn)行貯存。每一容器接種一種試驗(yàn)菌，接種量按供試品類別確定。若因供試品的性狀或每個(gè)容器裝量等因素需將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器時(shí)，該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性（如吸附作用），特別應(yīng)注意不得影響供試品的pH，pH對(duì)抑菌劑的活性影響很大，同時(shí)容器的口徑大小應(yīng)便于供試品的進(jìn)出及混勻。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(18

取包裝完整的供試品至少5份，直接接種試驗(yàn)菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至5個(gè)適宜的無菌容器中（若試驗(yàn)菌株數(shù)超過5株，應(yīng)增加相應(yīng)的供試品份數(shù)），每一容器接種一個(gè)試驗(yàn)菌。

1、2、3類供試品1g或1ml接種菌量為105～106cfu，4類供試品中1g或1ml接種菌量為103～104cfu，接種菌液的體積不得超過供試品體積的0．5%～1%，充分混合，使供試品中的試驗(yàn)菌均勻分布。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(194.貯存：接種的供試品在試驗(yàn)期間置20~25℃避光貯存，控制溫度變化盡可能小，并防止被污染。

5.存活菌數(shù)測(cè)定：根據(jù)產(chǎn)品類型及表2規(guī)定的時(shí)間，分別從上述每一容器取供試品1ml（g），用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1：10；1：100；1：1000等稀釋級(jí)，按驗(yàn)證過的菌數(shù)測(cè)定方法（由于供試品中含有抑菌活性，所以菌數(shù)測(cè)定方法應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證）測(cè)定供試品中所含的菌數(shù)，并換算成lg值。

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6.結(jié)果判斷：計(jì)數(shù)結(jié)果與初始值（0時(shí)菌數(shù)）的常用對(duì)數(shù)值比較，根據(jù)表2進(jìn)行判斷。試驗(yàn)結(jié)果按有效數(shù)字的修約規(guī)則進(jìn)舍，保留一位小數(shù)。結(jié)果符合表2要求可判斷該產(chǎn)品抑菌效力符合規(guī)定。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(21表防腐劑抗菌效力標(biāo)準(zhǔn)1類供試品細(xì)菌7天菌數(shù)下降不少于1.0lg，14天菌數(shù)下降不少于3.0lg，第14天到28天菌數(shù)不增加。真菌與初始值比，到7、14、28天菌數(shù)均不增加。

2類供試品細(xì)菌14天菌數(shù)下降不少于2.0lg，14天到28天菌數(shù)不增加。真菌與初始值比，到14、28天菌數(shù)均不增加。

3類供試品細(xì)菌14天菌數(shù)下降不少于1.0lg，14天到28天菌數(shù)均不增加。真菌與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增加。

4類供試品細(xì)菌，真菌與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增長(zhǎng)。注：1、表中“不增加”是指對(duì)前一個(gè)測(cè)定時(shí)間，試驗(yàn)菌增加的數(shù)量不超過0.5lg。

2、0時(shí)菌數(shù)供試品加入試驗(yàn)菌，搖勻，立即取樣檢查，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，為0時(shí)，即初始值。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(22

實(shí)例

1、氯化鈉注射液、碳酸氫鈉注射液不含抑菌劑加入菌從初始到6h就開始無限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液從初始到24h對(duì)數(shù)值無變化，72h后明顯降低，具一定的抑菌力。

2、呋麻滴鼻液、硫糖鋁混懸液、阿昔洛韋滴眼液、鯨脂滴耳液、潔爾陰洗液從初始值到7天后計(jì)算值大于1.0lg降低值，從初始值到14天后計(jì)算值大于3.0lg,具較強(qiáng)的抑菌效力。

3、波斯特是特效抑菌劑具極強(qiáng)的抑菌效力，72h抑菌效力達(dá)100%。采用對(duì)數(shù)值計(jì)算簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、易于判斷。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(23藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(24

本指導(dǎo)原則是為所采用的試驗(yàn)方法能否替代藥典規(guī)定方法用于藥品微生物的檢驗(yàn)提供指導(dǎo)。三類微生物檢驗(yàn)的新技術(shù)（1）基于微生物生長(zhǎng)信息的檢驗(yàn)技術(shù)，如生物發(fā)光技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、比濁法等；（2）直接測(cè)定被測(cè)介質(zhì)中活微生物的檢驗(yàn)技術(shù)，如固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法等；（3）基于微生物細(xì)胞所含有特定組成成分的分析技術(shù)，如脂肪酸測(cè)定技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、基因指紋分析技術(shù)等。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(25

微生物檢驗(yàn)的新技術(shù)與傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法比較，具有檢驗(yàn)簡(jiǎn)便，速度快的特點(diǎn)，有實(shí)時(shí)或近實(shí)時(shí)監(jiān)控的潛力，能夠?qū)ιa(chǎn)過程的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)作出及時(shí)的微生物質(zhì)量評(píng)價(jià)，使生產(chǎn)早期采取糾正措施及監(jiān)控和指導(dǎo)優(yōu)良生產(chǎn)成為可能，同時(shí)，新技術(shù)的使用也促進(jìn)了生產(chǎn)成本降低及檢驗(yàn)水平的提高，因此在醫(yī)藥行業(yè)完全有必要也有可能使用微生物檢驗(yàn)的替代方法。采用非藥典規(guī)定的替代方法進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗(yàn)證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典的方法。若替代方法只是針對(duì)藥典方法的某一環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)修改，則驗(yàn)證僅針對(duì)該替代技術(shù)而非整個(gè)檢驗(yàn)方法。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(26

藥品微生物檢驗(yàn)方法分為定性試驗(yàn)和定量試驗(yàn)。定性試驗(yàn)是測(cè)定樣品中是否存在活的微生物；定量試驗(yàn)是測(cè)定樣品中存在的微生物數(shù)量。替代方法的驗(yàn)證也分為定性和定量?jī)深悾煌愋托枰?yàn)證的參數(shù)不同，驗(yàn)證參數(shù)的設(shè)定借鑒了美國(guó)和歐洲藥典的規(guī)定，但又結(jié)合了我國(guó)國(guó)情。具體參數(shù)的設(shè)定見下表。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(27參數(shù)定性檢驗(yàn)定量檢驗(yàn)準(zhǔn)確度－＋精密度－＋專屬性＋＋檢測(cè)限＋－定量限－＋線性－＋范圍－＋重現(xiàn)性＋＋耐用性＋＋注：＋表示需要驗(yàn)證－表示不需要驗(yàn)證中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(28替代方法的一般要求

在以替代方法對(duì)樣品檢驗(yàn)的適用性進(jìn)行驗(yàn)證前，必須證明所選用的替代方法具有方法適用性，即表明在不含樣品的情況下，替代方法的專屬性、精密度、檢測(cè)限等參數(shù)。確認(rèn)方法的適用性后，用樣品按上表規(guī)定的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證至少用2個(gè)批號(hào)的樣品，每批樣品每個(gè)菌應(yīng)至少平行進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。參數(shù)驗(yàn)證的菌種應(yīng)包括培養(yǎng)基適用性檢查規(guī)定的菌種，必要時(shí)，還應(yīng)根據(jù)替代方法及樣品的特性增加相應(yīng)的菌種。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(29定性檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(301、專屬性：是指檢測(cè)樣品中可能存在的特定微生物種類的能力。強(qiáng)調(diào)應(yīng)關(guān)注樣品存在對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響在使用依賴培養(yǎng)技術(shù)（以微生物生長(zhǎng)作為判斷）的替代方法時(shí)，樣品的存在會(huì)導(dǎo)致檢驗(yàn)出現(xiàn)假陰性，應(yīng)特別確認(rèn)培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)試驗(yàn)及樣品的存在對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)于不依賴培養(yǎng)技術(shù)的替代方法，樣品的存在還可能導(dǎo)致檢驗(yàn)出現(xiàn)假陽性，應(yīng)特別確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)中的外來成分不得干擾試驗(yàn)，確認(rèn)樣品的存在不會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響。采用替代方法進(jìn)行控制菌的檢驗(yàn)，還應(yīng)選擇與控制菌具有類似特性的菌株作為驗(yàn)證對(duì)象。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(312、檢測(cè)限：是指在替代方法設(shè)定的檢驗(yàn)條件下，樣品中能被檢出的微生物的最低數(shù)量，該數(shù)量是指在稀釋或培養(yǎng)之前初始樣品所含有的微生物數(shù)量，而不是指檢驗(yàn)過程中某一環(huán)節(jié)的供試液中所含有的微生物數(shù)量。驗(yàn)證的關(guān)鍵是確定接種菌的最低數(shù)量（每單位不超過5cfu），分別用藥典方法和替代方法對(duì)該菌進(jìn)行檢驗(yàn)，比較兩種方法的差異。與國(guó)外藥典規(guī)定相同，要求試驗(yàn)菌的接種量應(yīng)能夠在采用藥典方法檢驗(yàn)時(shí)，有50％的檢出率。檢測(cè)限驗(yàn)證至少應(yīng)重復(fù)進(jìn)行5次。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(323、重現(xiàn)性：是指相同的樣品在正常的實(shí)驗(yàn)條件（如實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所、實(shí)驗(yàn)人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時(shí)，所得檢驗(yàn)結(jié)果的精密度。反映了微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。驗(yàn)證的關(guān)鍵是使接種菌的量在檢測(cè)限以上，評(píng)價(jià)驗(yàn)證結(jié)果時(shí)，應(yīng)排除樣品均一性的影響

4、耐用性：是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時(shí)的可靠性提供依據(jù)。對(duì)替代方法進(jìn)行耐用性評(píng)價(jià)，確定方法操作的關(guān)鍵注意點(diǎn)。在開展了上述評(píng)價(jià)后，可以不必比較替代方法的耐用性與藥典方法的差異。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(33定量檢驗(yàn)的方法驗(yàn)證中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(341、準(zhǔn)確度：是指替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果與藥典方法檢驗(yàn)結(jié)果的一致程度。準(zhǔn)確度的確認(rèn)應(yīng)在檢驗(yàn)的范圍內(nèi)。通常用微生物的回收率（％）來表示準(zhǔn)確度。驗(yàn)證的菌濃度應(yīng)該在檢測(cè)范圍內(nèi)，一般應(yīng)選擇能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的最高濃度，系列稀釋至較低濃度，并且至少應(yīng)該有5種濃度，每種濃度重復(fù)檢驗(yàn)5次。替代方法的回收率應(yīng)該達(dá)到70％以上。當(dāng)替代方法并不依賴微生物生長(zhǎng)出菌落或出現(xiàn)混濁來進(jìn)行定量時(shí)，可能出現(xiàn)回收率高于藥典方法的情況，此時(shí)應(yīng)結(jié)合專屬性的內(nèi)容對(duì)準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(35

2、精密度：是指在檢驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)同一個(gè)均勻的樣品多次重復(fù)取樣測(cè)定，其檢驗(yàn)結(jié)果的一致程度。通常采用標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）來表示。驗(yàn)證的菌濃度同準(zhǔn)確度，每種濃度重復(fù)檢驗(yàn)10次?？梢越邮艿南鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)不大于35％。一般來說，替代方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)不大于藥典方法。在該項(xiàng)目上，USP的規(guī)定是15％～35％，研究表明，當(dāng)含菌濃度在30～300cfu/ml時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD完全可能在15％以內(nèi)，因此，指導(dǎo)原則中對(duì)該指標(biāo)作了修改。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(363、專屬性：是指通過檢測(cè)適宜的試驗(yàn)菌，以證明檢驗(yàn)方法與其設(shè)定目的相適應(yīng)的能力。例如，菌落計(jì)數(shù)平皿法其設(shè)定目的在于檢出一定數(shù)量的微生物，則其專屬性驗(yàn)證應(yīng)證明當(dāng)樣品中存在一定數(shù)量的試驗(yàn)菌時(shí)，通過平皿法檢驗(yàn)，能夠檢出試驗(yàn)菌，而樣品的存在不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。驗(yàn)證的關(guān)鍵是合理評(píng)價(jià)樣品的存在對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，當(dāng)替代方法不依賴微生物生長(zhǎng)出菌落或出現(xiàn)混濁就可以定量時(shí)，這種評(píng)價(jià)顯得尤為必要。

4、定量限：是指樣品中能被準(zhǔn)確檢驗(yàn)的微生物最低數(shù)量。驗(yàn)證的關(guān)鍵是在檢驗(yàn)范圍的低限，選擇盡可能低的5種菌濃度，每種濃度重復(fù)測(cè)定5次，替代方法的定量限不得大于藥典方法。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(375、線性：是指在檢驗(yàn)范圍內(nèi)，檢驗(yàn)結(jié)果與樣品中微生物數(shù)量成比例關(guān)系的程度。線性驗(yàn)證時(shí)必須覆蓋能夠準(zhǔn)確檢測(cè)的所有濃度范圍。每株菌至少應(yīng)該有5種濃度，每種濃度至少測(cè)定5次。在對(duì)驗(yàn)證數(shù)據(jù)進(jìn)行處理時(shí)，應(yīng)以樣本中預(yù)期的菌濃度為自變量，以不同方法的計(jì)數(shù)結(jié)果為因變量，進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，替代方法的相關(guān)系數(shù)不得低于0.95。

6、范圍：是指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，檢驗(yàn)方法適用的高低限濃度或數(shù)量的區(qū)間。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(387、重現(xiàn)性：是指相同的樣品在正常的實(shí)驗(yàn)條件（如實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所、實(shí)驗(yàn)人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時(shí)，所得檢驗(yàn)結(jié)果的精密度。反映了微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。驗(yàn)證的關(guān)鍵是使接種菌的量在檢測(cè)限以上，評(píng)價(jià)驗(yàn)證結(jié)果時(shí)應(yīng)制備均一的實(shí)驗(yàn)樣本

8、耐用性：是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時(shí)的可靠性提供依據(jù)。當(dāng)檢驗(yàn)方法采用基于培養(yǎng)的技術(shù)時(shí)，一般的參數(shù)變化是指對(duì)培養(yǎng)溫度和時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，上述調(diào)整對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響并不顯著。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(39微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(40

此原則的制定是為了更好應(yīng)用微生物限度檢查法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)和方法中的特定內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用做進(jìn)一步說明。應(yīng)用此原則應(yīng)結(jié)合2010年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法詳細(xì)解讀。主要對(duì)以下各條作了明確。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(41對(duì)所用試劑的要求：有效性和無毒性。檢驗(yàn)方法的選擇：盡量選擇操作簡(jiǎn)便，快速及避免損傷供試品中污染的微生物的方法。對(duì)離心沉淀法的重新認(rèn)識(shí)：盡量避免采用該方法，更不宜采用高速離心沉淀集菌。對(duì)照培養(yǎng)基的說明：由中檢所研制及分發(fā)。無法消除供試品的抑菌作用時(shí)，可根據(jù)供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則選擇更高稀釋級(jí)試驗(yàn)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(42

6.控制菌的進(jìn)一步確認(rèn)應(yīng)選擇已被認(rèn)可的菌種鑒定方法。

7.藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售及新藥標(biāo)準(zhǔn)制定、進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核、考察藥品質(zhì)量、仲裁中，除品種或制劑通則項(xiàng)下另有規(guī)定外，其微生物限度均以藥典的“藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”為依據(jù)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(43

8.2010年版二部化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下⑴有微生物限度要求的制劑，微生物限度為必檢項(xiàng)目；⑵對(duì)于只有原則性要求的制劑（如：丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑），應(yīng)對(duì)其被微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。在保證產(chǎn)品對(duì)患者安全的前提下，通過回顧性驗(yàn)證或在線驗(yàn)證積累的微生物污染數(shù)據(jù)表明每批均符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的要求，那么可不進(jìn)行批批檢驗(yàn)，但必須保證每批最終產(chǎn)品均符合微生物限度規(guī)定。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(44

⑶上述固體制劑若因制劑本身及工藝的原因?qū)е庐a(chǎn)品易受微生物污染，應(yīng)在品種項(xiàng)下列出微生物限度檢查項(xiàng)及微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，如生化類制劑。

9.對(duì)局部給藥制劑控制更嚴(yán)格。用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無菌檢查法要求。對(duì)于創(chuàng)傷程度無法判斷的局部給藥制劑，若沒有證據(jù)證明藥品不存在安全性風(fēng)險(xiǎn)則應(yīng)符合無菌檢查法要求。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(45

10.制定藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，除了依據(jù)“藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)”外，還應(yīng)綜合考慮原料來源、性質(zhì)、生產(chǎn)工藝條件、給藥途徑及微生物污染對(duì)患者的潛在危險(xiǎn)等因素，提出合理安全的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，因此，必要時(shí)，特殊品種為保證其療效、穩(wěn)定性及避免對(duì)使用者的潛在危害性，應(yīng)制定更嚴(yán)格的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，并在品種項(xiàng)下規(guī)定，如眼用液體制劑，目前其生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)條件尚難達(dá)到無菌產(chǎn)品的要求，但從使用者的安全性考慮，建議按無菌產(chǎn)品的要求進(jìn)行控制。制定輔料、化學(xué)原料藥、中藥提取物的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，除參照相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)外，還應(yīng)綜合考慮相應(yīng)制劑及其生產(chǎn)工藝的特性。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(46

11.2010年版一部對(duì)動(dòng)物類原藥材粉作了明確規(guī)定，利于標(biāo)準(zhǔn)的正確理解和執(zhí)行。具體規(guī)定如下：含動(dòng)物類原藥材粉的口服中藥制劑要求不得檢出沙門菌。其中的動(dòng)物類原藥材粉是指除蜂蜜、王漿、動(dòng)物角、阿膠外的所有動(dòng)物類原藥材粉，如牡蠣、珍珠等貝類，海蜇、等水產(chǎn)品，冬蟲夏草、人工牛黃等。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(47藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(48

藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。藥品微生物的檢驗(yàn)結(jié)果受到很多因素的影響，如實(shí)驗(yàn)人員在取樣或試驗(yàn)過程中可能引入了污染微生物；微生物學(xué)分析方法本身的誤差較大；樣品中或環(huán)境中微生物可能分布不均勻等因素均影響藥品微生物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在藥品檢驗(yàn)中，為保證微生物試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和重現(xiàn)性，藥品微生物實(shí)驗(yàn)室必須使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測(cè)方法并按良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)試驗(yàn)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(49

藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范包括以下幾個(gè)方面：人員、培養(yǎng)基、菌種、實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行、設(shè)備、文件、實(shí)驗(yàn)記錄、結(jié)果的判斷等。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(50

一、人員從事藥品微生物試驗(yàn)工作的人員均要受到教育、培訓(xùn)及具備相關(guān)工作的經(jīng)驗(yàn)。

微生物實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識(shí)的教育背景。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)人員的崗位及職責(zé)對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的培訓(xùn)，在確認(rèn)他們可以承擔(dān)某一試驗(yàn)前，他們不能獨(dú)立從事該項(xiàng)微生物試驗(yàn)。應(yīng)保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必需的設(shè)備操作、微生物檢驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定所有級(jí)別實(shí)驗(yàn)人員的繼續(xù)教育計(jì)劃。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(51

微生物實(shí)驗(yàn)室管理人員包括工作人員和監(jiān)督人員，其專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平應(yīng)與他們的職責(zé)范圍相符。管理人員也應(yīng)接受系統(tǒng)的教育和微生物實(shí)驗(yàn)室的培訓(xùn)如：管理技能、實(shí)驗(yàn)室安全、試驗(yàn)按排、預(yù)算、實(shí)驗(yàn)室研究、實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查及技術(shù)報(bào)告書寫等。應(yīng)熟練的應(yīng)用SOP有關(guān)內(nèi)容到管理工作中；如制定不同工作崗位實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)課程和繼續(xù)教育計(jì)劃，隨時(shí)掌握和了解試驗(yàn)人員的水平，根據(jù)每個(gè)人的技術(shù)水平分配適宜的工作崗位。對(duì)所有人員的培訓(xùn)、考核內(nèi)容和結(jié)果均應(yīng)記錄。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(52二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基是絕大多數(shù)微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)。因此，培養(yǎng)基的質(zhì)量是微生物試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗(yàn)是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(53

⑴培養(yǎng)基的制備：可按處方制備也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的商品化成品培養(yǎng)基，脫水培養(yǎng)基除附有處方和使用說明外還應(yīng)注明有效期、貯存條件、適用性試驗(yàn)的質(zhì)控菌株和用途。配制時(shí)應(yīng)按使用說明上的要求操作，受潮結(jié)塊不能使用，以確保培養(yǎng)基的質(zhì)量符合要求。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(54

配制培養(yǎng)基使用的容器應(yīng)是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角燒瓶、刻度吸管、試管、培養(yǎng)皿等。使用的器皿應(yīng)洗凈，用蒸餾水沖凈，烘干后方可使用。禁用金屬容器如鐵、銅、鋁容器，避免金屬離子與培養(yǎng)基成分結(jié)合，生成有害物質(zhì)，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水，特殊情況下需要用去離子水和蒸餾水，對(duì)熱敏感的培養(yǎng)基應(yīng)用滅菌水和無菌容器配制與分裝，配制時(shí)若需加熱助溶應(yīng)注意溫度不要過高。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(55

配制培養(yǎng)基必須矯正pH，干燥培養(yǎng)基也必須對(duì)pH進(jìn)行驗(yàn)證，高壓滅菌前的pH應(yīng)比最終pH高0.2左右。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)按照生產(chǎn)商提供或使用者驗(yàn)證的參數(shù)進(jìn)行滅菌。商品化的成品培養(yǎng)基必須附有所用滅菌方法的資料，培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌技術(shù),特殊培養(yǎng)基可采用薄膜過濾除菌。對(duì)配制培養(yǎng)基的過程作詳細(xì)的記錄，記錄內(nèi)容包括：配制日期、培養(yǎng)基名稱、成分、配制數(shù)量、滅菌條件、質(zhì)量監(jiān)控結(jié)果等進(jìn)行全面詳細(xì)記錄。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(56

（2）培養(yǎng)基的貯藏商品化培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)使用說明書上的要求進(jìn)行儲(chǔ)存。培養(yǎng)基標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)有批號(hào)，生產(chǎn)日期、有效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性。所采用的保藏和運(yùn)輸條件應(yīng)使培養(yǎng)基最低限度失去水分并提供機(jī)械保護(hù)。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在避光的環(huán)境。若保存于非密閉容器中，一般在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般在一年內(nèi)使用，瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷凍破壞凝膠特性。若培養(yǎng)基要長(zhǎng)期保存，瓊脂平板應(yīng)密閉包裝或置于密閉容器中以防止水分流失。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(57

培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)立即取出，不得儲(chǔ)藏在高壓滅菌器中，避免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化應(yīng)在加熱的水浴中或采用流通蒸汽進(jìn)行，只允許一次，融化的培養(yǎng)基應(yīng)放在45～50℃的水浴中，不得超過8小時(shí)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(58

（3）培養(yǎng)基的質(zhì)量控制所有配制好的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證方法參照《中國(guó)藥典2010年版》附錄無菌檢查或微生物限度檢查項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室配制的培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控項(xiàng)目是外觀、性狀、pH、促生長(zhǎng)試驗(yàn)、定期的穩(wěn)定性檢查以及培養(yǎng)基有效期的確定。在實(shí)驗(yàn)室中，由同一批脫水培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基時(shí)，若采用已驗(yàn)證的配制和滅菌程序，那么可不進(jìn)行批批促生長(zhǎng)試驗(yàn)。如果培養(yǎng)基制備的方法未經(jīng)驗(yàn)證，那么，配制的每一批培養(yǎng)基必須進(jìn)行促生長(zhǎng)試驗(yàn)。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(59

用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基應(yīng)特別小心防護(hù)。尤其是用于關(guān)鍵區(qū)域監(jiān)控的培養(yǎng)基最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么在使用前應(yīng)進(jìn)行100%的預(yù)培養(yǎng)。這樣是為了防止將外來的污染帶到環(huán)境中及避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(60

無菌檢查用培養(yǎng)基使用前應(yīng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，適用性試驗(yàn)包括無菌性檢查和靈敏度檢查，無菌性試驗(yàn)是檢查培養(yǎng)基滅菌是否完全，靈敏度檢查是確定培養(yǎng)基的質(zhì)量好壞、穩(wěn)定與否，這對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有極為重要的影響。微生物限度檢查培養(yǎng)基

使用前應(yīng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，適用性試驗(yàn)包括促生長(zhǎng)、抑制及指示能力檢查。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(61

三、菌種微生物實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)菌株可能是最敏感的，因?yàn)樗鼈兊纳锘钚院吞匦砸蕾囉诤线m的試驗(yàn)操作和貯藏條件。實(shí)驗(yàn)室菌種的處理和保藏的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，使盡可能減少菌種污染和生長(zhǎng)特性的改變。按統(tǒng)一操作程序制備菌株是微生物試驗(yàn)結(jié)果一致性的重要保證。試驗(yàn)菌種應(yīng)是從國(guó)家菌種中心獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌種，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后保存.中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(62

菌種保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）成立于1979年。下設(shè)7個(gè)菌種保藏管理中心及有關(guān)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，共12個(gè)單位實(shí)行統(tǒng)一領(lǐng)導(dǎo)，按專業(yè)分工管理。普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(63工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所抗生素菌種保藏管理中心（CACC）中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)用生物技術(shù)研究所四川抗生素研究所華北制藥廠抗生素研究所獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CFCC）中國(guó)林業(yè)科學(xué)院專利微生物菌種保藏管理中心（ACCC）武漢大學(xué)中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(64

國(guó)外的菌種保藏機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（WFCC）美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）美國(guó)農(nóng)業(yè)部北部地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室（NRRL）英國(guó)國(guó)立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（NCTC）英國(guó)國(guó)際真菌研究所（CMI）荷蘭真菌中心保藏所（CBS）日本微生物菌種保藏聯(lián)合會(huì)（JFCC）中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(65

標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按驗(yàn)證的方法進(jìn)行。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株—從國(guó)內(nèi)、外菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后,既為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(66

菌種的保存低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都可以抑制微生物的代謝和生長(zhǎng)繁殖，因此低溫、干燥和真空是菌種保藏的重要手段。不同的微生物，應(yīng)根據(jù)其生物特征來選擇最適宜的保藏方法。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(67菌種培養(yǎng)基保存溫度傳接時(shí)間細(xì)菌一般為營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4～6℃芽孢菌3～6個(gè)月，其他細(xì)菌1個(gè)月酵母菌霉菌瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基4～6℃一般3～6個(gè)月真菌PDA瓊脂或改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基4～6℃一般3～6個(gè)月瓊脂斜面低溫保藏法中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(68菌種保存液（2mL）保存溫度保存時(shí)間金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯1%蛋白胨甘油水

10%～40%甘油-30～-80℃

半年以上

枯草芽孢桿菌大腸埃希菌膽鹽乳糖增菌液乙型副傷寒沙門菌銅綠假單孢桿菌生孢梭菌皰肉培養(yǎng)基白色念珠菌

改良馬丁培養(yǎng)基黑曲霉液體冷凍保藏法中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(69

菌種的傳代和使用

工作菌種的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代，（從菌種保藏中心獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代）防止過度的傳代造成菌種變異。1代是指將活的培養(yǎng)物接種到新鮮培養(yǎng)基中，任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。必要時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認(rèn)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(70凍干菌種（0代）↓適宜的增菌液約5mL溶解蘇醒（1代）↓增菌液培養(yǎng)復(fù)壯（2代）↓增菌液培養(yǎng)→→分裝冷凍保存適宜的斜面培養(yǎng)基→使用劃線傳代（3代）↓適宜的斜面培養(yǎng)基劃線傳代（4代）→使用→分裝冷凍保存↓適宜的斜面培養(yǎng)基劃線傳代（5代）→使用→分裝冷凍保存中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(71

經(jīng)過長(zhǎng)期保藏和傳代的菌種，由于種種原因發(fā)生衰退、變異和死亡。因此菌種在保藏期間必須定期檢查，發(fā)現(xiàn)變異或衰退，應(yīng)及時(shí)給予恢復(fù)。每隔一定時(shí)間間隔需對(duì)菌種重新復(fù)活、分離、純化、檢查鑒定和再保藏。主要檢查菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)、生化特性及血清學(xué)檢查。

中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(72

菌種的管理

1、使用菌種的單位，應(yīng)具備從事微生物工作的條件和設(shè)備。菌種應(yīng)由專人負(fù)責(zé)管理，管理人員應(yīng)具有微生物專業(yè)知識(shí)和技術(shù)水平，并應(yīng)具有較強(qiáng)的責(zé)任心。

2、實(shí)驗(yàn)室必須建立菌種保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌種標(biāo)注名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、傳代次數(shù)、進(jìn)出、收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)以及銷毀的記錄、標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購記錄、從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作記錄，如菌種定期轉(zhuǎn)種傳代，鑒定（純度、特性）、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、菌種保存的位置和條件及其它需要的程序。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(733、菌種應(yīng)冷藏或冷凍保存，保存菌種的冰箱不得放置食品和易揮發(fā)性藥品，放置菌種應(yīng)有專用的冰箱，應(yīng)上鎖管理。

4、由專人按操作規(guī)程和有關(guān)要求定期進(jìn)行傳代，并定期對(duì)保存的菌種進(jìn)行檢查，一般每年1～2次，（或定期更換凍干菌種）。發(fā)現(xiàn)菌種的異常情況應(yīng)及時(shí)檢查。一旦發(fā)現(xiàn)菌種污染和變異現(xiàn)象，應(yīng)立即報(bào)告、研究處理。尤其長(zhǎng)期保存時(shí)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(74中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(755、菌種的來源、接收、傳代、分離、復(fù)壯、使用和鑒定等均應(yīng)做好詳細(xì)記錄。

6、菌種不得隨意帶出實(shí)驗(yàn)室，外單位索取、購買應(yīng)有證明和登記登記，并包裝嚴(yán)密。菌種處理應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，滅菌處理應(yīng)有詳細(xì)記錄。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(76四、實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行

微生物實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃和設(shè)計(jì)應(yīng)充分考慮到微生物操作規(guī)范和實(shí)驗(yàn)室安全操作的要求，應(yīng)具有進(jìn)行微生物檢測(cè)所需的適宜環(huán)境和設(shè)施，其中最重要的是盡最大可能防止微生物對(duì)環(huán)境、人員、樣本造成污染和危害。合理的規(guī)劃及活動(dòng)區(qū)域的劃分將提高微生物實(shí)驗(yàn)室操作的可靠性。無菌室應(yīng)遠(yuǎn)離交通干道、廁所及污染區(qū)，應(yīng)選上、下水道及其他安裝適宜的位置。無菌室的配套設(shè)施包括洗刷、培養(yǎng)基配制、消毒滅菌、滅菌物品存放和傳輸、培養(yǎng)間、結(jié)果觀察、試驗(yàn)菌實(shí)驗(yàn)和辦公室等，要集中，減少污染，便于管理和使用。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(77

通常，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分成潔凈區(qū)、無菌區(qū)和培養(yǎng)區(qū)等，無菌區(qū)域應(yīng)與培養(yǎng)區(qū)完全分開。否則應(yīng)采用其它屏障和無菌技術(shù)來減少偶然污染的可能性。這些屏障包括防護(hù)服、衛(wèi)生處理和消毒措施及采用隔離器技術(shù)生物安全柜。微生物檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合《中國(guó)藥典》無菌檢查、微生物限度檢查試驗(yàn)環(huán)境的要求，無菌檢查、微生物限度檢查、無菌采樣等應(yīng)有獨(dú)立設(shè)置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并配備相應(yīng)的細(xì)菌（真菌）實(shí)驗(yàn)室、培養(yǎng)室、培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)用具準(zhǔn)備（包括滅菌）區(qū)、樣品接收和儲(chǔ)藏區(qū)、標(biāo)準(zhǔn)菌株儲(chǔ)藏區(qū)、污染物處理區(qū)和文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時(shí)，應(yīng)對(duì)上述區(qū)域明確標(biāo)識(shí)。中國(guó)藥典2010版藥品微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)原則(78

實(shí)驗(yàn)室對(duì)所用的消毒劑應(yīng)定期更換，使用的消毒劑應(yīng)無菌。污染微生物的樣品，需