PCR及其衍生技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究

曹寧：PCR及其衍生技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究安徽工程大學(xué)PAGE2PAGE1PCR及其衍生技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究摘要：,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的快速檢測(cè)病原微生物技術(shù)得到了迅速的發(fā)展。由于PCR技術(shù)具有敏感、專一等特點(diǎn),不僅可以對(duì)病原微生物進(jìn)行特異性識(shí)別,而且可以鑒別同一種類病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行病原微生物的檢測(cè)具有十分獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。文章介紹了PCR及其衍生技術(shù)RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫-PCR、多重PCR、套式引物PCR、巢式PCR及在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：PCR、病原微生物、檢測(cè)、應(yīng)用1、PCR檢測(cè)技術(shù)的原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PolymeraseChainReaction,PCR)，又稱為無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(FreeBacteriaCloningTechnique)，是一種根據(jù)生物體內(nèi)DNA復(fù)制的某些特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，在體外對(duì)特定DNA序列進(jìn)行快速擴(kuò)增的技術(shù)。自美國(guó)Cetus公司人類遺傳室KaryMullis及其同事于1985年發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以來(lái)，PCR技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)就以驚人的速度發(fā)展起來(lái)，在多種核酸檢測(cè)技術(shù)中都得到了廣泛的運(yùn)用。PCR反應(yīng)體系主要由寡核昔酸(引物)、4種dNTP、TaqDNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液體系組成，它改變了傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過(guò)活細(xì)胞，而是將擴(kuò)增建立在三步重復(fù)發(fā)生反應(yīng)的基礎(chǔ)上：①通過(guò)熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核昔酸上；③酶促延仲引物與DNA配對(duì)合成模板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應(yīng)。溶液中核昔酸通過(guò)聚合酶的作用形成互補(bǔ)的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA，成為下次PCR復(fù)制的模板。因而每次循環(huán)特異性DNA片斷將以雙倍量增加，典型擴(kuò)增經(jīng)過(guò)20~4次循環(huán)能引起100萬(wàn)倍的擴(kuò)增，大大提高了DNA的得率。因此，當(dāng)知道待檢病原具有某一特定基因片段時(shí)，即可利用特異性的引物對(duì)樣品中微量的目標(biāo)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，增加靶DNA數(shù)量，使其達(dá)到足夠的檢測(cè)量，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增出的特定片斷，即可確定感染的病原。2、PCR及其衍生技術(shù)在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用2.1、普通PCR的應(yīng)用普通PCR的原理就是根據(jù)病毒或其他病原體的已知保守核昔酸序列設(shè)計(jì)出引物，對(duì)待測(cè)核酸的特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增，之后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，通過(guò)是否能擴(kuò)增出特異性條帶來(lái)判斷樣品中是否有病原DNA。由于普通PCR技術(shù)具有高度的敏感性，同時(shí)又能直接擴(kuò)增無(wú)需增菌的樣品，因此，在病原微生物快速檢測(cè)，尤其是突發(fā)公共衛(wèi)生事件快速檢測(cè)方面大有用武之地。彭宣憲[1]等采用細(xì)菌的16srRNA基因保守區(qū)特異引物，以嗜水氣單胞菌、魯克氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)和鰻弧菌等6種常見(jiàn)病原菌為對(duì)象，建立了PcR一SScP技術(shù)，能完成對(duì)多個(gè)病原的同時(shí)檢測(cè)，特異性好且快捷、經(jīng)濟(jì)。李業(yè)鵬[2]等選取沙門菌屬侵襲性抗原保守基因invA基因上的靶序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)方法鑒定過(guò)的22種77株沙門菌和24株非沙門菌進(jìn)行非特異性檢測(cè)，并對(duì)人工污染的食品進(jìn)行檢測(cè)條件研究，采用普通PCR技術(shù)在19h內(nèi)可檢出含有沙門菌102CFU/g的食品，與傳統(tǒng)方法相比既縮短了檢測(cè)時(shí)間，又可對(duì)大量樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。2.2、RT-PCR的應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR(Reversetranseription-polymerasechainreaction,RT-PCR)，其原理就是用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA后用PCR對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。較PCR而言，RT-PCR顯示出了更高的靈敏性。Lin[3]對(duì)從馬拉巴石斑魚(yú)(E‘malabaricus)和紫石斑魚(yú)(E.laneeolatus)分離的NNV編碼衣殼蛋白的RNA2基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序。江育林[4]等也用RT-PCR法快速檢測(cè)出了桃拉病毒。包紅梅[5]等通過(guò)分析流感數(shù)據(jù)庫(kù)中123個(gè)HA序列,根據(jù)HA保守區(qū)序列設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)引物,建立了一步法RT-PCR檢測(cè)方法,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為732bp。用該方法檢測(cè)H1~H15亞型AIV和雞新城疫病毒等其他14種禽病病原,結(jié)果僅有H9亞型AIV出現(xiàn)特異性目的條帶,而其他均未出現(xiàn)目的條帶。臟器及咽喉、泄殖腔棉拭子樣品在1∶10稀釋度下,病毒分離和RT-PCR方法可以達(dá)到相同的陽(yáng)性檢出率。表明建立的AIVH9亞型RT-PCR方法具有較好的特異性和敏感性。2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timeQuantitativepolymerasechainreactionn）與以前的以終點(diǎn)法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)相比具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。首先，它不僅操作簡(jiǎn)便、快速高效，高通量，而且具有很高的敏感性、重復(fù)性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，大大降低了污染的可能性，并且無(wú)須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)PCR儀中,指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或熒光染料,利用熒光信號(hào)積累,從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析的方法[6]。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)環(huán)境中的微生物病原體,無(wú)需培養(yǎng)而是直接取樣進(jìn)行分析。特異性強(qiáng)、靈敏度高、迅速簡(jiǎn)便且具有較高的精確度。Brooks[7]等對(duì)雨季時(shí)海水中的甲肝病毒,采用該技術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)及定量分析。研究證明,該技術(shù)對(duì)甲肝病毒的定性及定量測(cè)定均有很高的精確度。同時(shí)指出了PCR技術(shù)對(duì)于環(huán)境微生物定量測(cè)定的發(fā)展前景。黃世旺[8]等建立了定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物對(duì)其特異性及敏感性等進(jìn)行了研究，并用副溶血性弧菌、志賀菌等10余種其他腸道細(xì)菌進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)靈敏度高達(dá)10CFU/ml，明顯高于常規(guī)PCR的檢出限90CFU/ml，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程只需2h。2008年,美國(guó)的Yang[9]針對(duì)16SrRNA基因保守取設(shè)計(jì)通用引物,用實(shí)時(shí)PCR先進(jìn)行寬范圍擴(kuò)增,再進(jìn)行革蘭分型及種特異性檢測(cè)。對(duì)121份膿毒性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液進(jìn)行檢測(cè),對(duì)所有細(xì)菌保守序列檢測(cè)的敏感度為10CFU/mL,36種常見(jiàn)膿毒性關(guān)節(jié)炎有關(guān)菌種特異的探針進(jìn)行革蘭分型和種特異檢測(cè),敏感度和特異度是傳統(tǒng)方法的95%和97%,革蘭分型符合率是100%,從收到標(biāo)本到出結(jié)果花費(fèi)3h的時(shí)間。2.4免疫-PCR的應(yīng)用免疫PCR技術(shù)是1992年，SanoT.等建立的檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)[10]。該技術(shù)將血清學(xué)中抗原抗體反應(yīng)，與聚合酶鏈反應(yīng)特異擴(kuò)增一段DNA分子的技術(shù)結(jié)合起來(lái)，用一段具體的DNA分子標(biāo)記抗體，應(yīng)用此抗體去檢測(cè)抗原，PCR擴(kuò)增此段DNA分子，電泳定性，根據(jù)此段DNA分子是否存在，來(lái)顯示抗原是否存在。其一般程序如下：在酶聯(lián)板內(nèi)包被捕獲抗原的抗體，加入待檢測(cè)抗體，溫育后充分洗滌，PCR擴(kuò)增粘附在抗體/抗原復(fù)合物上的DNA分子，電泳顯示結(jié)果。在病毒感染的檢測(cè)方面,有許多研究人員利用免疫PCR技術(shù)對(duì)病毒感染進(jìn)行了檢測(cè)。Kakizald[11]等報(bào)道T在感染的是腳魚(yú)(serioladumem勸中運(yùn)用免疫PCR檢測(cè)病原巴斯德氏菌，結(jié)果表明利用它可檢測(cè)出34cf/m的病原菌，而對(duì)照使用的ELISA方法只能檢測(cè)出3.4xl04cf/ml的菌。McKie[12]等對(duì)血清中腮腺炎病毒的特異性抗體進(jìn)行了檢測(cè)。在細(xì)菌檢測(cè)方面。Huang[13]等建立了檢測(cè)金黃色葡萄球菌的高靈敏度的免疫PCR方法。Monteiro[14]等將磁珠技術(shù)和免疫PCR技術(shù)相結(jié)合,設(shè)計(jì)了一種能檢測(cè)糞便中幽門螺桿菌的新方法。王中民[15]等利用鏈親和素和生物素之間的高度親和力,采用生物素化羊抗鼠IgG作二抗,將單抗與DNA相連接,建立免疫PCR檢測(cè)方法,用以檢測(cè)顆粒性抗原細(xì)菌,并與ELISA方法進(jìn)行了比較。2.5套式引物PCR的應(yīng)用套式引物PCR一般是在擴(kuò)增更大片斷的目的DNA時(shí)采用，即先用非特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用特異性引物對(duì)第一次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行帶二次擴(kuò)增，以獲得可供分析的目的DNA。夏春[16]等根據(jù)魚(yú)源嗜水氣單胞菌p溶血素基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，采用套式PcR法證實(shí)了我國(guó)嗜水氣單胞菌流行株亦存在p溶血素的基因，并建立了PCR檢測(cè)產(chǎn)β溶血素嗜水氣單胞菌的方法。Glukhov[17]等以操縱子ctxAB基因DNA區(qū)的引物進(jìn)行套式PCR檢測(cè)霍亂弧菌(V.cholera)產(chǎn)毒株霍亂毒素基因，具有極高的靈敏度和特異性。2.6多重PCR的應(yīng)用多重PCR(Multiplexpolymerasechainreaction)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR,它是在同一PCR反應(yīng)體系里加入兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng),其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般PCR相同。最早由Chamberlian等于1988年首次提出來(lái),目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物領(lǐng)域,包括基因敲除分析、突變、多態(tài)性分析、定量分析、RNA檢測(cè)及微生物耐藥檢測(cè)等,不僅是科研的主要手段,也具有很高的實(shí)用價(jià)值。影響多重PCR的因素有很多,其中Mg2+的濃度很關(guān)鍵,所以在引物設(shè)計(jì)相對(duì)特異的前提下,實(shí)現(xiàn)對(duì)多重PCR體系中各條件的摸索,尤其是Mg2+濃度的優(yōu)化,是建立起高效、準(zhǔn)確的多重PCR檢測(cè)體系的必然過(guò)程。多重PCR是在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加人多對(duì)引物，在同一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體，從而節(jié)省檢測(cè)的時(shí)間和資金。李晨[18]等根據(jù)目前水產(chǎn)上常見(jiàn)病原菌鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌的毒力相關(guān)基因,選擇具有特異性的鰻弧菌調(diào)控毒力蛋白表達(dá)的基因、嗜水氣單胞菌中重要的編碼氣溶素基因aerA、遲緩愛(ài)德華氏菌中編碼分泌系統(tǒng)裝置蛋白的基因evpA,分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,建立可同時(shí)特異性地檢測(cè)3種菌的多重PCR檢測(cè)體系。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并測(cè)試了其特異性和靈敏度。梁會(huì)營(yíng)[19]等建立嬰幼兒奶粉中常見(jiàn)病原菌的多重PCR檢測(cè)方法。根據(jù)阪崎腸桿菌外膜蛋白A(ompA)基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因序列,設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物。對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立針對(duì)嬰幼兒奶粉中常見(jiàn)病原菌的多重PCR檢測(cè)方法,并對(duì)奶粉進(jìn)行模擬檢測(cè)。兩對(duì)引物能特異擴(kuò)出282bp和482bp的目的條帶;在優(yōu)化條件下,可同時(shí)檢測(cè)模擬樣品中兩菌DNA,靈敏度達(dá)到103CFU/ml。2.7、巢式PCR的應(yīng)用巢式PCR(nestedPCR,nPCR)是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。王偉平[20]等探討巢式酶鏈聚合反應(yīng)(PCR)技術(shù)快速檢測(cè)泌尿生殖道致病性支原體在臨床上的應(yīng)用。以支原體16S~23S保守區(qū)域基因?yàn)閿U(kuò)增靶序列設(shè)計(jì)通用引物,采用巢式PCR方法擴(kuò)增微小脲原體(Up)、解脲脲原體(Uu)、生殖支原體(Mg)和人型支原體(Mh)4種支原體。巢式PCR檢測(cè)靈敏度高于一步PCR(χ2=5.857,P<0.05),巢式PCR擴(kuò)增出4種支原體的標(biāo)準(zhǔn)株,對(duì)1份生物樣品可同時(shí)檢測(cè)出4種致病性支原體,避免了誤診、漏診,提高診治效率。姜敏[21]）等評(píng)價(jià)巢式聚合酶鏈反應(yīng)(nested-PCR)技術(shù)在b型流感嗜血桿菌(Hib)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值,估計(jì)氨芐西林耐藥Hi中b型的比率。對(duì)2000—2003年北京、上海、廣州細(xì)菌監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中,呼吸道感染兒童鼻咽部分離培養(yǎng)的899株Hi,用E試驗(yàn)法檢測(cè)氨芐西林耐藥情況后,用nested-PCR與玻片凝集法對(duì)氨芐西林耐藥菌株進(jìn)行b型檢測(cè)。檢出74株氨芐西林耐藥Hi。nested-PCR與玻片凝集法檢測(cè)Hib的結(jié)果一致,74株氨芐西林耐藥Hi中有2株為Hib,約占2.7%。nested-PCRb型莢膜檢測(cè)方法可作為玻片凝集法的一個(gè)重要補(bǔ)充。3、結(jié)語(yǔ)聚合酶鏈反應(yīng)以其敏感、特異、快速等特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)中。PCR不僅自身可以用來(lái)檢測(cè)病原體，也可以與其他技術(shù)相結(jié)合充分發(fā)揮其優(yōu)點(diǎn)。例如，魯衛(wèi)平[22]等人結(jié)合納米金新型基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，構(gòu)建采用通用引物的一次PCR法實(shí)現(xiàn)一次對(duì)多個(gè)臨床常見(jiàn)致病性酵母菌的檢測(cè)分析。通過(guò)PCR與其他技術(shù)的聯(lián)用可以解決了一些技術(shù)上的難題。通過(guò)PCR技術(shù)的不斷完善以及與其他新技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，PCR及其衍生技術(shù)在病原微生物的檢測(cè)中將有非常好的應(yīng)用前景。且隨著分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,PCR技術(shù)的不足會(huì)逐漸得到改進(jìn),將會(huì)成為未來(lái)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的研究工具,廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)[1]彭宣憲,高華，王三英.等.采用通用引物PCR配合SSCP和RFLP技術(shù)檢測(cè)魚(yú)病病原菌[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000，24(4):345-348.[2]李業(yè)鵬，鐘凱，楊寶蘭，等．食品中沙門菌PCR檢測(cè)方法的建立［J］．中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006，18(1):17-22[3]LinCS,LuMW,TangL,etal.Charaeterizationofviruslikepartielesassembledinarecombinantbaculovirussystemex2pressingthecapsidproteinofafishnodavirus[J].Virology，2001，290(l):50-58.[4]江育林，高隆英，史秀杰，等.用RT-PCRR快速檢測(cè)Taura綜合癥病毒陰.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14(2):8-9.[5]包紅梅,王秀榮,陶啟蒙,蔡?hào)|東,王馥梅,趙玉輝,陳化蘭.H9亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010,40(04):384-389[6]SchmittgenTD.Real-timequantitativePCR[J].Methods,2001,25(4):383-385.[7]HilaryABrooks,RichardMGersberg,ArunKDhar.De-tectionandquantificationofhepatitisAvirusinseawaterviareal-timeRT-PCR[J].JournalofVirologicalMethods,2005,127(2):109-118.[8]黃世旺，盧亦愚，徐丹戈，等．TaqMan熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)霍亂弧菌的方法建立［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16(8):923-924．[9]YangS,RamachandranP.RapidPCR-baseddiagnosisofsepticarthritisbyearlyGram-typeclassificationandpathogenidentification[J].JClinMicrobio,l2008,46(4):1386-1390[10]SanoT,SmithCL,CantorCR.Science,1992;258(5079):120-122[11]KakizaldE，MiyoshiSI.Detectionofbaeterialantigensusingimmuno-PCR[J」.LettApplMicmbiol，1996，23(2):101-103.[12]McKieA,SamuelD,CohenB,etal.Developmentofaquantitativeimmuno-PCRassayanditsusetodetectmumps-specificIgGinserum.JImmunolMethods,2002,261(1-2):167-175[13]HuangSH,ChangTC.DetectionofStaphylococcusaureusbyasensitiveimmuno-PCRassay.ClinChem,2004,50(9):1673-1674.[14]MonteiroL,GrasN,MegraudF.Magneticimmuno-PCRassaywithinhibitorremovalfordirectdetectionofHelicobacterpyloriinhumanfeces