基因工程知識點(diǎn)總結(jié)歸納更新版

基因工程緒論克隆〔clone〕：作名詞：含有目的基因的重組DNA分子或含有重組分子的無性繁殖。作動詞：基因的別離和重組的過程?；蚬こ獭瞘eneengineering〕：體外將目的基因插入病毒、質(zhì)粒、或其他載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入到原先沒有這些基因的宿主細(xì)胞內(nèi)，且能穩(wěn)定的遺傳。供體、受體和載體是基因工程的三大要素。基因工程誕生的根底三大理論根底：40頭覺察了生物的遺傳物質(zhì)是DNA；50頭弄清晰DNA的雙螺旋構(gòu)造和半保存復(fù)制機(jī)理；60頭確定遺傳信息的遺傳方式。以密碼方式每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子代表一個(gè)氨基酸。三大技術(shù)根底：限制性內(nèi)切酶的覺察；DNA連接酶的覺察；載體的覺察基因工程的技術(shù)路途：切：DNA片段的獲得；接：DNA片段與載體的連接；轉(zhuǎn)：外源DNA片段進(jìn)出受體細(xì)胞；選：選擇基因；表達(dá)：目的基因的表達(dá)；基因工程的工具酶限制性內(nèi)切酶〔restrictionenzymes〕：主要是從原核生物中別離純化出來的，是一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。限制酶的命名：屬名〔斜體〕+種名+株系+序數(shù)3、II型限制性內(nèi)切酶識別特定序列并在特定位點(diǎn)切割4、同裂酶：來源不同，其識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均一樣的限制酶。5、同尾酶：來源不同，識別的靶序列不同，但產(chǎn)生一樣的黏性末端的酶形成的新位點(diǎn)不能被原來的酶識別。6、限制性內(nèi)切酶的活性：在適當(dāng)反響條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解1ug特定的DNA底物，所須要的限制性內(nèi)切酶的量為1個(gè)酶活力單位。7、星號活性：變更反響條件，導(dǎo)致限制酶的專一性和酶活力的變更。8、DNA連接酶的特點(diǎn)：具有雙鏈特異性，不能連接兩條單鏈DNA分子或閉合單鏈DNA，連接反響是吸能反響，最適反響溫度是4至15度，最常用的是T4連接酶。9、S1核酸酶：特異性降解單鏈DNA或RNA。10、RNAH降解與DNA雜交的RNA，用于cDNA文庫建立時(shí)除去RNA以進(jìn)展第二鏈的合成。11、DNA聚合酶：(1)、DNA聚合酶I：5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性，5’—3’聚合酶活性，用處：除去3’端突起。補(bǔ)齊5’端突起。合成cDNA第二鏈。切口移位探針的制備。(2)、Klenow大片段：沒有5’→3’外切酶活性，而保存了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用處:用同位素標(biāo)記具5’端突起的DNA片段末端。補(bǔ)平5’粘性末端。DNA序列測定。合成cDNA第二鏈。(3)、Taq酶：75度為最適反響溫度，95度仍具有穩(wěn)定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。主要修飾酶：(1)堿性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基團(tuán)。(2)T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移5’-OH上(3)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在3’端高效添加脫氧核苷酸。分子克隆載體分子克隆載體：是一類可供外源DNA片段插入并攜帶重組分子進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)展擴(kuò)增或表達(dá)的DNA分子。分子克隆載體的功能：為外源基因供應(yīng)進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移實(shí)力為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合的實(shí)力為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)的實(shí)力載體的分類：按用處分：克隆載體、表達(dá)載體、整合載體按來源分：原核生物載體：質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體、M13噬菌體載體、cosmid載體、phagemid載體；真核病毒載體載體的特點(diǎn)：至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因此至少可在一個(gè)生物體中自主復(fù)制至少有一個(gè)克隆位點(diǎn)，可供外源DNA插入至少有一個(gè)標(biāo)記基因，以學(xué)問載體或重組DNA分子是否進(jìn)入受體細(xì)胞具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)標(biāo)記基因的作用：外源基因是否插入載體分子形成重組子；外源載體是否進(jìn)入宿主細(xì)胞標(biāo)記基因的種類：抗性標(biāo)記基因；養(yǎng)分標(biāo)記基因；生化標(biāo)記基因；噬菌斑常用的遺傳標(biāo)記基因：四環(huán)素抗性基因〔Tc〕；氨芐青霉素抗性基因〔Ap〕；氯霉素抗性基因〔Cm〕；卡那霉素〔Kan〕；新霉素〔Neo〕；β—半乳糖甘酶基因〔LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因〔Gus〕；熒光素酶基因；發(fā)光蛋白質(zhì)基因。按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體：質(zhì)粒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體〔有低拷貝和高拷貝〕ARS復(fù)制型—染色體復(fù)制型〔一般拷貝數(shù)比較高〕病毒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自病毒，假設(shè)為RNA必需反轉(zhuǎn)錄為cDNA〔高拷貝〕混合復(fù)制型：不同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合〔穿梭載體〕根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分：質(zhì)粒載體、病毒型載體、混合型載體根據(jù)載體功能分類：1〕一般型載體：至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因。如PBR322和pUC載體2〕表達(dá)型載體：3類：Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)〔調(diào)控序列+啟動子〕+終止子；Ⅱ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)〔核糖體結(jié)合序列和起始密碼子〕+終止子；Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子〔常稱之為表達(dá)分泌型載體〕3〕失控型質(zhì)粒載體(Run-awayplasmidvector)：是一些低拷貝質(zhì)粒，其復(fù)制限制是溫度敏感型或藥物敏感型，在不同溫度或不同藥物濃度下，質(zhì)?？截悢?shù)會顯著變更。4〕探針型載體：該類載體主要特點(diǎn)是含有一些特別的DNA序列，用于特定的探討目的，如別離基因啟動子、終止子、DNA復(fù)制起點(diǎn)等。5)定序型載體：主要用于核苷酸的序列測定6)整合型載體：主要用于基因治療，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。9、標(biāo)記基因與拷貝的關(guān)系：假設(shè)標(biāo)記基因的表達(dá)效率較高，宿主細(xì)胞可能不大量表達(dá)標(biāo)記基因以滿意選擇壓力的要求，因此載體的拷貝數(shù)會降低，可實(shí)行相應(yīng)方法進(jìn)步拷貝數(shù)。如：對于藥物抗性標(biāo)記基因，可進(jìn)步藥物的濃度。對于養(yǎng)分標(biāo)記基因，可降低該基因的表達(dá)效率。大腸桿菌分子克隆載體克隆載體的種類1〕質(zhì)粒載體—復(fù)制起點(diǎn)來自一些自然質(zhì)粒。2〕噬菌體載體—λ，P1和M13、fd載體，復(fù)制起點(diǎn)來自噬菌體。3〕COS質(zhì)粒載體—質(zhì)粒載體中插入λcos片段，以利于體外包裝4〕噬粒載體〔phagemid〕—有質(zhì)粒和M13、fd的復(fù)制起點(diǎn)，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制。質(zhì)粒的特點(diǎn)：質(zhì)粒DNA的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在質(zhì)粒DNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的不相容性和不相容群質(zhì)粒DNA的消退質(zhì)粒的整合大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制：以RNAⅡ?yàn)橐锖铣?，RNAⅠ與RNAⅡ結(jié)合可削減質(zhì)粒的拷貝數(shù)，使RNAⅠ復(fù)制起點(diǎn)上游一個(gè)核苷酸處G突變?yōu)門，使得拷貝數(shù)增多。質(zhì)粒的不親和性：在沒有選擇壓力的狀況下，兩種親緣關(guān)系親密的不同質(zhì)粒，不行以在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。主要是由于他們在復(fù)制功能之間的互相干擾造成。λ噬菌體的構(gòu)造特點(diǎn)：線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12個(gè)核苷酸，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長48.5kb。熱誘導(dǎo)表達(dá)：λclts857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts857下游，重組體的目的基因在42℃表達(dá)，30℃不表達(dá)。λ噬菌體載體的缺點(diǎn)：基因組太大；酶切點(diǎn)太多；野生型只能接納確定長度的DNA。λ噬菌體載體的改造：切去非必需片段，加載目的基因去掉太多的酶切位點(diǎn)增加標(biāo)記基因COS質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：在一般質(zhì)粒載體中插入一個(gè)或兩個(gè)來自λ的cos位點(diǎn)片段，雙cos載體比單cos載體易于重組。COS質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：容量大，用于基因簇的克??；形成的重組DNA分子可進(jìn)展體外包裝，并能感染大腸桿菌細(xì)胞；操作簡潔，易于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；對重組DNA分子長度具有選擇性包裝。噬粒載體〔phagemid〕：在質(zhì)粒載體中插入一段M13或fd的復(fù)制起點(diǎn)，其插入方向確定在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈?；虿僮鞯闹饕夹g(shù)原理核酸別離提取的原則：保證核算的一級構(gòu)造的完好性；解除其他分子的污染質(zhì)粒載體別離的關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒與DNA與宿主染色體DNA分開根據(jù)：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA提取過程中，染色體斷裂成片段，而質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型3、變性法提取質(zhì)粒DNA的原理：在變性條件〔堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補(bǔ)鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)變性條件復(fù)原時(shí)，質(zhì)粒DNA快速復(fù)性復(fù)原自然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀構(gòu)造，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。RNA別離純化的關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿；抗高溫寒冷；抗變性劑，酶活性不須要扶植因子，存在范圍廣。因此操作時(shí)要進(jìn)展高溫滅菌或用焦碳酸二乙酯處理或強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑等。核酸的濃縮：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的鹽離子和雜質(zhì)。核酸凝膠電泳的根本原理：核酸分子中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在電場中將向正極挪動，通過凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子別離，分子量小的DNA，具有較嚴(yán)密的構(gòu)型，在凝膠中挪動快；反之，分子量大的DNA挪動慢。核酸凝膠電泳常運(yùn)用溴酚藍(lán)作為指示劑、溴化乙錠作為染色劑9、脈沖場凝膠電泳原理：加在凝膠上至少有兩個(gè)電場方向，使得DNA分子要不斷地調(diào)整泳動方向，不同分子量大小的DNA分子用于變更泳動方向的時(shí)間不同，則可以得到別離10、雙脫氧核苷酸終止法的原理：雙脫氧〔2'，3'〕-核苷酸可以象2'-脫氧核苷酸那樣干脆摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列11、雙脫氧核苷酸終止法的過程：制備單鏈DNA，與引物退火，分為4個(gè)反響體系，每個(gè)體系中參與dNTP和一種雙脫氧核苷酸，DNA聚合酶定序反響，反響產(chǎn)物變性后電泳，凝膠枯燥，放射自顯影，根據(jù)條帶讀出堿基序列，再根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則寫出DNA鏈的序列?！擦粢猓阂约簩懸粋€(gè)序列，然后寫上每個(gè)體系中出現(xiàn)片段的序列，然后根據(jù)序列畫出電泳圖，考試考的可能性大，書上有步驟〕12、Maxam-Gilbert化學(xué)法原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反響，在堿性環(huán)境下硫酸二甲酯能使堿基G發(fā)生甲基化，在酸性環(huán)境下哌啶甲酸使A和G脫嘌呤，堿性環(huán)境下肼使C和T發(fā)生開環(huán)，在高鹽濃度下肼只使C開環(huán)。然后發(fā)生1~2個(gè)堿基的脫落或取代，最終發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列13、化學(xué)法測序的優(yōu)點(diǎn)、不須要模板、引物和DNA聚合酶。14、Southern雜交〔Southernblot〕：用一種或多種限制性內(nèi)切酶對基因組DNA加以切割，通過瓊脂糖凝膠電泳別離酶切片段，隨后，使DNA在原位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用核苷酸片段加以標(biāo)記作為探針，通過分子雜交來檢測待測樣品中是否存在互補(bǔ)的核酸序列。Southern雜交的一般步驟：DNA的制備→DNA酶切→電泳〔瓊脂糖凝膠電泳〕→DNA原位轉(zhuǎn)膜→探針雜交→放射自顯影→結(jié)果分析Northern雜交檢測的是RNA。步驟與southern類似，不須要酶切。Western雜交：雜交的對象是蛋白質(zhì)，先將蛋白質(zhì)從SDS中轉(zhuǎn)移到一固相支持物上，通過與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反響進(jìn)展檢測。主要用于基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測。Western雜交的一般步驟：蛋白質(zhì)制備→SDS→電轉(zhuǎn)移至膜上→一抗的制備→一抗與膜結(jié)合〔1h〕→洗膜〔30min〕→二抗與膜的結(jié)合→洗膜→顯色反響→結(jié)果分析17、PCR反響體系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超純水。18、引物設(shè)計(jì)的一般原則：引物的長度常為17至30個(gè)堿基；GC含量為40%至60%；Tm值高于55；兩條引物之間配對堿基數(shù)小于5；引物自身配對的堿基數(shù)小于3?；蛭膸斓慕⒒蚪M文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。建立基因組文庫的一般程序:載體DNA片段的制備：DNA別離，限制酶切割，脫磷酸化反響供體DNA片段的制備：總DNA純化，再進(jìn)展機(jī)械或酶切割成特定大小的DNA片段。供體和載體DNA的連接:要留意混合的比率和濃度重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴(kuò)增基因組文庫質(zhì)量的評價(jià)：文庫規(guī)模、重組頻率利用λ載體構(gòu)建基因組文庫:載體DNA片段的制備的方法：左右臂DNA片段的獲得供體DNA片段的制備：限制酶部分酶切，機(jī)械剪切法重組DNA分子的形成：限制混合的比率重組DNA分子的包裝：制備包裝物，然后進(jìn)展包裝基因組文庫的擴(kuò)增為進(jìn)步文庫的質(zhì)量，實(shí)行以下措施:雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以防止其自身形成串狀體供體DNA脫磷酸化以防止供體DNA間的連接導(dǎo)致重排載體和供體DNA末端修飾以防止上述兩種情形發(fā)生:載體補(bǔ)CT，供體補(bǔ)GA承受文庫快速構(gòu)建法以防止擴(kuò)增文庫時(shí)DNA丟失基因組文庫的載體可載入DNA大?。嘿|(zhì)粒最大15kb相宜構(gòu)建cDNA文庫；亞克隆噬菌體最大25kbcDNA文庫COS質(zhì)粒30-45kb基因組文庫噬粒最大12kbcDNA文庫P170-90kb基因組文庫BAC100-500kb基因組文庫YAC250-1000kb基因組文庫鳥槍法克隆目的基因：隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的選擇程序從眾多克隆中別離出含有目的基因的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆別離。鳥槍法克隆基因的步驟：染色體DNA的切斷；與載體連接；轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；選擇含有目的基因的目的重組子。鳥槍法的改良:目的基因的酶切圖譜；在連接前將DNA片段進(jìn)展分級別離鳥槍法克隆基因的局限性：工作量較大，須要理解目的基因的背景學(xué)問不能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)果cDNA文庫：從確定生長階段或條件的某種細(xì)胞別離到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再重組和增值所產(chǎn)生的無性繁殖系的總和。cDNA文庫的特點(diǎn)：基因特異性；器官特異性；代謝或發(fā)育特異性；不勻整性；cDNA均可獲得表達(dá)建立cDNA文庫的一般程序載體DNA片段的制備多聚〔A〕RNA的別離制備雙鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法合成單鏈cDNA，堿解或酶解除去RNA合成第二鏈ds-cDNA與載體DNA相連：人工接頭、同聚物加尾、cDNA的定向插入重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫的建立:質(zhì)粒載體則轉(zhuǎn)化大腸桿菌、噬粒則包裝感染第二鏈合成的方法：自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法。前兩者5’端會有幾個(gè)堿基缺失。目的基因的別離和鑒定獲得基因的一般方法：化學(xué)合成法:主要用于較小基因的合成或須要變更堿基半化學(xué)合成法：mRNAcDNA加人工接頭或合成一段DNA與載體相連、選擇法：用各種方法從基因文庫或cDNA文庫中選擇目的基因基因選擇的方法:遺傳互補(bǔ)法原理：當(dāng)一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，假設(shè)受體細(xì)胞獲得某種新的性狀，則此片段上攜帶著確定新性狀的遺傳基因。養(yǎng)分缺陷型受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入外源DNA片段之后，涂布在合成培育基上可以生長；無某種表型的細(xì)胞會有新性狀；某些產(chǎn)酶細(xì)胞則可能過量產(chǎn)酶。釀酒酵母MFα基因的選擇：基因組文庫DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞在缺乏亮氨酸的培育基上培育能生長的重組子即含合成亮氨酸的基因核酸雜交法原理：利用核酸探針與待別離DNA的同源序列可進(jìn)展雜交的特點(diǎn)別離目的基因。別離步驟：基因(基因組或cDNA)文庫→制備DNA樣品膜→與標(biāo)記探針雜交→雜交斑點(diǎn)〔陽性克隆〕→別離重組DNA分子→作斑點(diǎn)雜交→陽性克隆→Southern雜交以確認(rèn)雜交結(jié)果→DNA進(jìn)一步證明和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級構(gòu)造比較；別離插入片段進(jìn)展基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測表達(dá)產(chǎn)物。免疫法原理:外源DNA引入宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此蛋白質(zhì)為抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生免疫反響，然后利用二抗與一抗反響，用二抗偶聯(lián)的酶反響選擇目的基因。別離步驟:基因文庫→蛋白質(zhì)樣品膜制備→免疫法選擇→有色斑點(diǎn)〔陽性克隆〕→進(jìn)一步證明：別離陽性克隆無細(xì)胞抽提物，作斑點(diǎn)印跡，western印跡免疫分析；別離重組DNA，檢測插入片段大小，測序等。染色體巡查法蛋白質(zhì)-DNA雜交法蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合法，即酵母雙雜交法原理：利用釀酒酵母的GAL4蛋白質(zhì)N端和C端分別交融的兩種蛋白質(zhì)互相作用可激活具有UAS〔上游激活序列〕報(bào)告基因表達(dá)選擇目的基因的方法。GAL4蛋白質(zhì)基因是一個(gè)調(diào)控基因，限制半乳糖利用酶類基因的表達(dá)，其5’端存在UAS。GAL4存在兩個(gè)構(gòu)造域：N端具有UAS-DNA結(jié)合域〔BD〕，C端具有轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域〔AD〕，這兩個(gè)構(gòu)造域可以單獨(dú)起作用。假設(shè)AD和BD分別與兩個(gè)基因編碼序列交融，且兩種蛋白質(zhì)能互相作用，就可導(dǎo)致GAL-LacZ基因的表達(dá)。與BD交融的基因稱為釣餌基因，與AD交融的基因稱為目的基因。用于基因別離和鑒定的扶植方法：抑制消減雜交法；差異雜交法；阻斷翻譯法；釋放翻譯雜交法植物基因工程植物組織培育技術(shù)：愈傷組織培育、細(xì)胞懸浮培育、原生質(zhì)體、植株再生植物基因轉(zhuǎn)移方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、原生質(zhì)體法、電擊法、顯微注射法植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記基因〔kan、Hyg、Bar〕、報(bào)告基因〔Bt、Gus、GFP〕、啟動子〔CaMVA)Ti質(zhì)粒有六個(gè)功能區(qū)：致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與在不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移毒性區(qū)〔Vir〕：干脆參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體DNA復(fù)制區(qū)〔Rep〕：參與Ti質(zhì)粒DNA復(fù)制將致瘤區(qū)交換成目的基因即可取出冠癭根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一般步驟：葉盤法：從植物葉片上用打孔器取假設(shè)干葉片→制備含有目的基因的Ti質(zhì)?！鷮①|(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→置于含農(nóng)桿菌的培育基24小時(shí)→將葉片轉(zhuǎn)移至選擇培育基上→誘導(dǎo)愈傷組織→誘導(dǎo)生根→移栽轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中的應(yīng)用：抗蟲、抗病毒、抗真菌、抗除草劑、抗逆、改良作物品種轉(zhuǎn)基因植物的問題：轉(zhuǎn)基因緘默：位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄程度的基因緘默、轉(zhuǎn)錄后程度的基因緘默。選擇基因平安性問題；對生態(tài)環(huán)境的影響動物基因工程從遺傳學(xué)角度劃分：遺傳性動物基因工程、非遺傳性動物基因工程2、動物基因工程載體具備的功能：為外源基因供應(yīng)進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移實(shí)力為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合的實(shí)力為外源基因供應(yīng)在受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)的實(shí)力動物基因工程載體：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、定向打靶載體〔基因敲入、基因敲除、基因下調(diào)〕哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記：遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物選擇藥物作用機(jī)理APH-氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸復(fù)原酶氨甲喋呤DHFR突變體抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A基因轉(zhuǎn)移技術(shù)：物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體法生物法：病毒感染法轉(zhuǎn)基因動物制備程序：DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠：基因制備→促排卵→結(jié)扎、假孕鼠→取受精卵→顯微注射DNA→胚胎移植→基因分型分析胚胎干細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動物過程：轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞的獲得→胚囊注射→嵌合體的檢測和育種轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植法消費(fèi)轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因的鑒定：標(biāo)記選擇法：正負(fù)選擇標(biāo)記選擇法、無啟動子選擇法分子鑒定法：PCR擴(kuò)增、斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、熒光原位雜交表達(dá)程度的檢測：報(bào)告基因、Northern雜交、反轉(zhuǎn)錄P