哺乳動(dòng)物構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化全人源初級抗體庫分析研究 臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

討論抗體作為人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，成為了當(dāng)下醫(yī)學(xué)研究工作者的熱門研究對象?？贵w的發(fā)展經(jīng)歷了以下發(fā)展過程。第一代抗體是血清多克隆抗體。第二代抗體是由1975年英國科學(xué)家Milstein和KohlerADDINNE.Ref.{C4E77045-9CAE-421D-A3AC-70E1431A5B14}[31]所用B細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞系通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗發(fā)明的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體。繼重組蛋白后，單克隆抗體已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要部分，由于其靶向性強(qiáng)、療效好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究和使用。在疾病的治療上，其應(yīng)用廣闊，已被成功用于治療各系統(tǒng)的疾病，如心血管系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，血液系統(tǒng)，腎臟，免疫系統(tǒng)、腫瘤、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病ADDINNE.Ref.{C0A50E05-F538-4699-B329-84E9ABE4E48C}[32]。單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位。單克隆抗體的發(fā)展經(jīng)歷了四個(gè)階段，最先出現(xiàn)的是鼠源性單克隆抗體；隨后便是嵌合性單克隆抗體；再后來是人源化單克隆抗體；目前則是全人源單克隆抗體。通過雜交瘤技術(shù)獲得的單克隆抗體是鼠源性抗體，在應(yīng)用于人體體內(nèi)時(shí)，存在著誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)(humananti-mouseantibodyHAMA)的風(fēng)險(xiǎn)，安全性較差。且鼠源性單克隆抗體在人體應(yīng)用時(shí)，無抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用（CDC）等相關(guān)的免疫效應(yīng)，應(yīng)用受到了限制。后來，研究人員利用分子生物學(xué)技術(shù)對雜交瘤的鼠源抗體進(jìn)行了改造，便獲得了人-鼠嵌合抗體和重構(gòu)抗體。第三代抗體是基因工程抗體，主要包括人鼠嵌合抗體、人源化抗體、完全人源抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體等。它是隨著DNA重組技術(shù)的飛速發(fā)展和抗體基因結(jié)構(gòu)功能的發(fā)現(xiàn)而出現(xiàn)的，它的出現(xiàn)是抗體生產(chǎn)技術(shù)的又一次重大突破，進(jìn)一步拓展了抗體的應(yīng)用范圍ADDINNE.Ref.{DBBB799F-70E2-461C-AE09-F48910BED7F9}[33,34]。它的出現(xiàn)降低了免疫原性、提高了抗體親和力、延長了抗體在體內(nèi)的半衰期。展顯出了許多雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體不具有的優(yōu)點(diǎn)。特別是全人源化的單克隆抗體，其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是來自人的，沒有免疫原性，已被廣泛應(yīng)用。全人源抗體制備的相關(guān)技術(shù)主要有：人雜交瘤技術(shù)、EB病毒（EBV）轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)（phagedisplay）、轉(zhuǎn)基因小鼠抗體制備技術(shù)（transgenicmouse）和單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等。通過這些技術(shù)制備的全人源抗體藥物，其親和力高、特異性高、毒副作用小，克服了以往的各種單克隆抗體的缺點(diǎn)，成為了治療性抗體藥物發(fā)展的必然趨勢?？贵w庫及抗體展示技術(shù)是當(dāng)前生產(chǎn)單克隆抗體的重要技術(shù)ADDINNE.Ref.{5E8C5A42-E278-4CC1-B797-75E976F60145}[35]。包括了噬菌體展示、核糖體展示、細(xì)菌展示、酵母展示等多種抗體展示技術(shù)ADDINNE.Ref.{7F55EBC9-7B49-4EF7-A54F-7A750059CDA2}[36,37]。其中，又以噬菌體展示ADDINNE.Ref.{45966BC8-DE60-4B78-9EC9-F5A4351DFB7F}[38]抗體庫及其篩選技術(shù)應(yīng)用最廣、發(fā)展也較成熟。構(gòu)建噬菌體展示抗體庫的步驟如下：首先，采集供者的免疫組織(如外周血淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞等)，設(shè)計(jì)抗體重鏈和輕鏈基因序列的PCR引物、采用RT-PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，插入噬菌體表達(dá)載體后構(gòu)建抗體基因庫；其次，將該抗體基因庫克隆至適當(dāng)?shù)氖删w顆粒的外殼蛋白上的適當(dāng)位置，即可獲得噬菌體展示抗體庫。隨后，用抗原與展示該抗體的噬菌體顆粒反應(yīng)，得到了能夠識別抗原的噬菌體顆粒文庫；將這些噬菌體顆粒文庫感染大腸桿菌宿主進(jìn)行擴(kuò)增，通過數(shù)輪“抗原與噬菌體顆粒結(jié)合、非特異性抗體洗滌、特異性抗體的洗脫和擴(kuò)增”的淘選過程，再利用突變和鏈置換的方法即可獲得高特異性的抗體ADDINNE.Ref.{DE293641-D3C9-47A4-B504-40571242F88A}[39]。雖然利用噬菌體展示技術(shù)在某種程度上推動(dòng)了抗體研究的進(jìn)步，得到了全人源的單克隆抗體，成功避免應(yīng)用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)獲得的鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)應(yīng)用時(shí)誘發(fā)的人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)。然而，噬菌體展示技術(shù)也有許多缺點(diǎn)。在噬菌體展示過程中要經(jīng)歷轉(zhuǎn)化細(xì)菌，以及噬菌體包裝等過程，一定程度上降低了庫的容量和多樣性，容量一般限制在109。另一方面，噬菌體是一種原核生物，其蛋白質(zhì)的表達(dá)機(jī)制與真核生物蛋白質(zhì)的表達(dá)機(jī)制存在著差異；所獲得的特異性單克隆抗體必須轉(zhuǎn)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，才能進(jìn)行抗體的大量生產(chǎn)。這種差異的存在，導(dǎo)致在噬菌體中高表達(dá)的抗體蛋白不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得很好的表達(dá)。再者，一旦成功構(gòu)建了噬菌體庫，就很難在體外進(jìn)行重組和突變，大大降低了遺傳多樣性。最后，噬菌體展示系統(tǒng)表達(dá)的抗體僅是抗原結(jié)合片段(Fab)或單鏈可變區(qū)抗體片段(scFv)等小分子抗體，無法展示并篩選全長抗體。因此，以上缺點(diǎn)限制了噬菌體抗體展示技術(shù)在抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)是目前抗體工業(yè)生產(chǎn)與制備最常用的抗體表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)錄后修飾與人體一致，在生物學(xué)功能、理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)等方面，其表達(dá)的抗體更接近天然的蛋白質(zhì)。而且，該系統(tǒng)展示的抗體是完整的全長人源抗體。因此，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)成為目前篩選人源抗體最理想的技術(shù)。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)要實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體的展示必須滿足抗體能夠展示在細(xì)胞膜表面。通過在載體上插入融合血小板衍生生長因子受體（Platelet-derivedgrowthfactorreceptors，PGF-R）跨膜(transmembranedomain,TM)序列ADDINNE.Ref.{14C2B308-8BCB-49CF-A21F-308676760D4B}[40]，即可使抗體錨定在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面。本研究通過把載體pcDNA5-FRT/XXX改造位pcDNA5-VH-TM，在其Fab抗體重鏈末端連接PDGF-R跨膜區(qū)序列便于抗體展示在細(xì)胞膜表面。隨后又構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞全人源表達(dá)載體pcDNA-DHL，優(yōu)化了基因克隆等實(shí)驗(yàn)條件ADDINNE.Ref.{19F79F3D-EF90-4066-9018-C2465BD5CD59}[41]建立了大容量的全長抗體基因庫。為特異性全長抗體的直接篩選奠定了基礎(chǔ)。庫的容量和多樣性是衡量一個(gè)抗體庫質(zhì)量的重要參數(shù)，建立庫容量大、多樣性好的抗體庫是篩選獲得特異性抗體的前提條件ADDINNE.Ref.{A7875D82-4655-4A2F-90B1-882FEDA437C4}[42,43]。為了保證庫容量足夠大、不在實(shí)驗(yàn)過程中降低抗體庫的多樣性，本研究在構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體時(shí)選擇了非回文結(jié)構(gòu)的限制性內(nèi)切酶BsmBI和SfiI。這兩種內(nèi)切酶酶切時(shí)形成的粘性末端(表1-1)是非回文結(jié)構(gòu)的ADDINNE.Ref.{66DA87E0-F1A9-4608-A289-7970401A772F}[44]，不會(huì)發(fā)生自我連接，能夠保證各片段之間正確、高效率地連接，從而大大提高了抗體庫構(gòu)建過程中的連接效率，保證了抗體庫的質(zhì)量。而其他構(gòu)建抗體庫時(shí)常用的限制性內(nèi)切酶如HindIIl，BamHl，NheI，XhoI，SaII，NotI等，切割后會(huì)形成回文結(jié)構(gòu)，發(fā)生自我連接，從而降低了連接的效率。表1-1在pcDNA-DHL中所選用的兩種酶的末端序列Tab1-1EndingsequenceofthetwoenzymesusedinpcDNA-DHLBsmBI5'-CGTCTCTAGTCC-3'3'-GCAGAGATCAGG-5'SfiI5'-GGCCACATAGGCC-3'3'-CCGGTGTATCCGG-5'接下來我們將全長人源抗體基因庫(pcDNA-DHL)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了檢測。從圖1-3可見，在39.2%的293F細(xì)胞表面檢測到了抗體表達(dá)。當(dāng)我們同時(shí)轉(zhuǎn)染了抗體重鏈基因庫和輕鏈基因庫時(shí)，有27%的細(xì)胞表面可檢測到抗體表達(dá)。但是，當(dāng)只轉(zhuǎn)染了輕鏈基因庫，而沒有轉(zhuǎn)染重鏈基因庫時(shí)，細(xì)胞表面沒有檢測到抗體表達(dá)。發(fā)生此結(jié)果是因?yàn)樵谒矔r(shí)轉(zhuǎn)染輕鏈基因庫時(shí)，由于沒有重鏈基因庫，而跨膜序列在重鏈基因庫中，因而在細(xì)胞表面檢測不到抗體表達(dá)。如果能夠在細(xì)胞表面檢測到抗體表達(dá)，說明同時(shí)有重鏈的存在。因此，在用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測的時(shí)候，用抗輕鏈的抗體進(jìn)行標(biāo)記，可以定量分析全長抗體在細(xì)胞表面的表達(dá)情況。以上結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞全長人源抗體庫中的全長抗體可以成功地展示在293F細(xì)胞的表面。為下一步構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化全人源二級抗體庫奠定了基礎(chǔ)。第二部分構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化全人源初級抗體庫實(shí)驗(yàn)方法（一）抗體輕鏈K型全長基因各亞型和重鏈可變區(qū)基因各亞型的擴(kuò)增1.抗體重鏈可變區(qū)各亞型基因的擴(kuò)增以人外周血淋巴細(xì)胞來源的cDNA為模板，用特異性引物（vhF1~vhF6）的混合物擴(kuò)增重鏈各亞型可變區(qū)基因片段，PCR體系為外周血淋巴細(xì)胞來源的cDNA0.5ul5’引物VHF混（10mmol/L）2μL3’引物VHR混（10mmol/L）2μL去離子水20.5μL2×GoTaqGreenMasterMix25μL總體積50μLPCR擴(kuò)增條件：95℃5min；95℃15s，65℃15s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃2min；16℃hold。擴(kuò)增結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)條帶位置正確。于紫外燈下，用潔凈手術(shù)刀片，切取相應(yīng)大小的片段條帶。參照Promega瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，回收純化輕重鏈各亞型的可變區(qū)，Biodrop儀器檢測回收DNA條帶的濃度及260/280比值，-20℃保存?zhèn)溆谩?.抗體輕鏈K型全長各亞型基因片段的擴(kuò)增以人外周血淋巴細(xì)胞來源的cDNA為模板，用特異性引物（ckF1~ckF6）混合物擴(kuò)增輕鏈全長各亞型基因片段，PCR體系為外周血淋巴細(xì)胞來源的cDNA0.5ul5’引物CKF（10mmol/L）2μL3’引物CKR（10mmol/L）2μL去離子水20.5μL2×GoTaqGreenMasterMix25μL總體積50μLPCR擴(kuò)增條件：95℃5min；95℃15s，56℃15s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃2min；16℃hold。擴(kuò)增結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)條帶位置正確。于紫外燈下，用潔凈手術(shù)刀片，切取相應(yīng)大小的片段條帶。參照Promega瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，回收純化輕鏈全長各亞型基因片段，Biodrop儀器檢測回收DNA條帶的濃度及260/280比值，-20℃保存?zhèn)溆?。（二）哺乳?dòng)物細(xì)胞表面展示載體pcDNA5-VH-TM、pCDNA5-CK及重鏈可變區(qū)各亞群和輕鏈全長各亞群PCR產(chǎn)物的酶切。1、AgeI-HF和XhoI內(nèi)切酶酶切載體pcDNA5-VH-TM質(zhì)粒pcDNA5-VH-TM(4ug)CutsmartBuffer10μLAgeI-HF2μLXhoI2ul去離子水XμL總體積100μL反應(yīng)條件：37℃條件下反應(yīng)60min。酶切結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳得到兩個(gè)條帶，說明酶切充分，紫外燈下切下較長的目的片段即載體骨架區(qū)片段。參照Promega瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，Biodrop檢測回收DNA條帶的濃度及260/280比值，-20℃保存?zhèn)溆谩?．用AgeI-HF和XhoI內(nèi)切酶酶切載體pCDNA5-CK質(zhì)粒pcDNA5-CK(4ug)CutsmartBuffer10μLAgeI-HF2μLXhoI2ul去離子水XμL總體積100μL反應(yīng)條件：37℃條件下反應(yīng)60min。酶切結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳得到兩個(gè)條帶，說明酶切充分，紫外燈下切下較長的目的片段即載體骨架區(qū)片段。參照Promega瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，Biodrop檢測回收DNA條帶的濃度及260/280比值，-20℃保存?zhèn)溆谩?．AgeI-HF和XhoI內(nèi)切酶酶切重鏈各亞型可變區(qū)PCR產(chǎn)物重鏈各亞型可變區(qū)基因1ugCutsmartBuffer2.5μLAgeI-HF0.5μLXhoI0.5ul去離子水XμL總體積25μL反應(yīng)條件：37℃反應(yīng)60min。酶切結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)條帶位置正確。用DpnI酶1ul，37℃，30min先降解模板，80℃，20min使酶失活后直接回收，Biodrop儀器檢測回收DNA條帶的濃度及260/280比值，-20℃保存?zhèn)溆谩?.用AgeI-HF和XhoI內(nèi)切酶酶切輕鏈全長各亞群PCR產(chǎn)物輕鏈全長各亞群PCR產(chǎn)物(1ug)CutsmartBuffer2.5μLAgeI-HF0.5μLXhoI0.5ul去離子水XμL總體積25μL反應(yīng)條件：37℃，60min。酶切結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)條帶位置正確。用DpnI酶1ul，37℃，30min先降解模板，80℃，20min使酶失活后直接回收，Biodrop儀器檢測回收DNA條帶的濃度及260/280比值，-20℃保存?zhèn)溆?。（三）目的基因片段與載體的連接1、抗體輕鏈全長各亞型基因與酶切后載體pcDNA5-CK的連接將酶切后的輕鏈全長各亞型基因片段插入到pcDNA5-CK載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，獲得了可以表達(dá)抗體輕鏈庫的載體pcDNA-ck。連接時(shí)插入片段與載體的摩爾比為3:1，其連接反應(yīng)體系為:T4DNAligase2.5μL10×T4ligaseBuffer5μLpcDNA5-CK333ng酶切后輕鏈全長各亞型片段72ng去離子水XμL總體積50μL2、抗體重鏈可變區(qū)各亞型基因與載體pcDNA5-VH-TM的連接將酶切后的重鏈可變區(qū)各亞型基因片段插入到pcDNA5-VH-TM載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，以獲得可以表達(dá)抗體重鏈庫的pcDNA-vh。連接時(shí)插入片段與載體片段的摩爾比為3:1，其連接反應(yīng)體系為:T4DNAligase2.5μL10×T4ligaseBuffer5μLpcDNA5-VH333ng酶切后重鏈可變區(qū)各亞型片段72ng去離子水XμL總體積50μL（四）轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌建庫：取適量上述兩個(gè)連接混合物體系冷卻反應(yīng)液，加入100ul感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰上放置30min，42℃熱激45-90s，冰水浴2min，加入900ulLB培養(yǎng)基，37℃孵育10min復(fù)蘇，37℃搖菌45min。取100ul菌液涂于平板上，剩余菌液3000rpm，5min離心后，棄大部上清，混勻涂于板上，倒置，37℃過夜。隨后用液態(tài)培養(yǎng)基回收培養(yǎng)板上的細(xì)菌菌落，離心、棄上清，提質(zhì)粒，此為全長人源初級抗體庫pcDNA-vh和pcDNA-ck。（五）抗體庫的挑克隆與測序鑒定分別在所構(gòu)建的重鏈初庫pcDNA-vh與輕鏈初庫pcDNA-ck的菌落中，各隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆菌落，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增后交華大基因公司進(jìn)行基因測序分析。三、結(jié)果1、DNA片段的酶切及電泳純化（1）、質(zhì)粒pcDNA5-VH-TM的酶切及電泳純化使用限制性內(nèi)切酶AgeI-HF和XhoI雙酶切質(zhì)粒pcDNA5-VH-TM后，在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳、分離純化。從圖2-1中可見，質(zhì)粒pcDNA5-VH-TM酶切后生成兩個(gè)片段，回收其中的大片段（約5kb大小），為載體骨架片段。（2）重鏈可變區(qū)基因VH的酶切及電泳純化使用內(nèi)切酶AgeI-HF和XhoI雙酶切重鏈各亞型可變區(qū)基因片段后，在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳、分離純化。從圖2-2中可見，抗體重鏈各亞型可變區(qū)基因片段酶切后生成兩個(gè)片段，回收其中約380bp的片段。（3）質(zhì)粒pcDNA5-CK的酶切及電泳純化使用內(nèi)切酶AgeI-HF和XhoI雙酶切質(zhì)粒pcDNA5-CK后，在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳、分離純化。從圖2-3中可見，質(zhì)粒pcDNA5-CK酶切后生成兩個(gè)片段，回收其中的大片段（約5kb），為載體骨架片段。（4）輕鏈全長基因的酶切、純化使用內(nèi)切酶AgeI-HF和XhoI酶切輕鏈各亞型全長基因后，在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳、分離純化。從圖2-4中可見，抗體輕鏈各亞型全長片段酶切后生成兩個(gè)片段，回收其中約700bp的片段。2、抗體庫的庫容量酶切后抗體重鏈基因和輕鏈基因分別與經(jīng)AgeI-HF和XhoI雙酶切的載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK由T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α細(xì)胞中。倍比稀釋后均勻涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)板上，計(jì)數(shù)生長密度均勻的培養(yǎng)板上長出的克隆，計(jì)算出所構(gòu)建的重鏈基因初級抗體庫容量為1.79×105，輕鏈基因初級抗體庫容量為1.8×105。隨機(jī)從重鏈初庫和輕鏈初庫中分別挑取10個(gè)單克隆進(jìn)行基因測序分析，結(jié)果顯示，在重鏈初庫的10個(gè)單克隆中有8個(gè)克隆的編碼序列是正確的，編碼8個(gè)特異的氨基酸序列；輕鏈初庫的10個(gè)單克隆中有9個(gè)克隆的編碼序列是正確的，編碼9個(gè)特異的氨基酸序列。理論上抗體庫的多樣性可以達(dá)到2.3x1010[（1.79x105x80%）X（1.8X105X90%）]。3、討論抗體的制備隨著醫(yī)學(xué)生物學(xué)的不斷發(fā)展也在不斷優(yōu)化，人工生產(chǎn)的抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)乃至其他各個(gè)領(lǐng)域，為人類治療疾病提供了新的治療方法ADDINNE.Ref.{46283BB7-65AA-4BB8-9945-05A00B84F549}[49]。其中，抗體以單克隆抗體為主，單克隆抗體的演變經(jīng)歷了從雜交瘤技術(shù)、抗體庫技術(shù)到抗體展示及篩選技術(shù)等多個(gè)階段ADDINNE.Ref.{5F51579D-9D32-4073-8CA0-23F1ECA187F6}[26]。早期通過雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，由于在治療疾病過程中會(huì)引起人抗鼠抗體反應(yīng)的危險(xiǎn)，因而限制了其使用。后來發(fā)現(xiàn)的抗體庫及抗體展示技術(shù)，使研究人員們制備出了全人源序列的單克隆抗體。這一發(fā)現(xiàn)直接減少了抗體的免疫原性，消滅了其他抗體誘發(fā)的HAMA反應(yīng)，降低了抗體的毒副作用。因此，要大規(guī)模生產(chǎn)治療性抗體，獲得全人源抗體則是解決這一問題的必要條件ADDINNE.Ref.{15A27793-344B-4519-A5C4-1CFFF6D2FF61}[50]。而抗體庫的庫容量，多樣性大小決定了是否能篩選出高親和力的抗體。當(dāng)庫容量達(dá)到109-1010時(shí)就有可能篩選出高親和力的抗體了，此時(shí)的親和力相當(dāng)于二次免疫反應(yīng)ADDINNE.Ref.{CC7AF5A0