化妝品衛(wèi)生規(guī)范

化妝品衛(wèi)生規(guī)范HygienicStandardforCosmetics(2002年版)中華人民共和國衛(wèi)生部二OO二年九月第一部分總則GeneralPrinciple第二部分毒理學試驗方法MethodsofToxicologicalTest第三部分衛(wèi)生化學檢驗方法MethodsofHygienicChemicalTestforCosmetics第四部分微生物檢驗方法MethodsofMicrobiologicalExaminationforCosmetics第五部分人體安全性和功效評價檢驗方法MethodsofSafetyandFunctionalEvaluationforCosmeticsonHumanBody范圍本規(guī)范規(guī)定了對化妝品原料以及化妝品最終產(chǎn)品的衛(wèi)生要求。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內銷售的化妝品。2規(guī)范性引用文件歐盟化妝品規(guī)程（Dir．76／768／EEC2000年3月版）（TheCosmeticsDirectiveoftheCouncilEuropeanCommunities，Dir．76／768／EEC，March,2000）。3定義本規(guī)范采用下列定義化妝品是以涂抹，噴灑或其它類似方法，施于人體表面任何部位（皮膚、毛發(fā)、指甲、口唇、口腔粘膜等），以達到清潔、消除不良氣味、護膚、美容和修飾目的的產(chǎn)品。4化妝品的一般要求4.1化妝品不得對施用部位產(chǎn)生明顯刺激和損傷。4.2化妝品必須使用安全，且無感染性。5對產(chǎn)品的要求5.1化妝品的微生物學質量應符合下列規(guī)定5.1.5.1.25.1.35.1.45.2化妝品中所含有毒物質不得超過表1中規(guī)定的限量。表1化妝品中有毒物質限量有毒物質限量，mg/kg備注汞1含有機汞防腐劑的眼部化妝品除外鉛40含醋酸鉛的染發(fā)劑除外砷10甲醇20006對原料的要求6.1禁止使用表2（1）中所列物質為化妝品組分。6.2禁止使用表2（2）中所列物質為化妝品組分。6.3凡以表3中所列物質為化妝品組分的，必須符合表中所作規(guī)定。6.4化妝品中所用防腐劑必須是表4中所列物質，并必須符合表中的規(guī)定。6.5化妝品中所用紫外線吸收劑必須是表5中所列物質，并必須符合表中的規(guī)定。6.6化妝品中所用著色劑必須是表6中所列物質，并必須符合表中的規(guī)定。7對包裝的要求化妝品的直接容器材料必須無毒，不得含有或釋放可能對使用者造成傷害的有毒物質。衛(wèi)生部文件衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕229號衛(wèi)生部關于印發(fā)化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2002年版）的通知各省、自治區(qū)、直轄市衛(wèi)生廳局，衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督中心，中國疾病預防控制中心，有關單位：現(xiàn)將新修訂的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2002年版）印發(fā)給你們，本規(guī)范自2003年1月1日起實施。各有關單位應嚴格依照本規(guī)范進行化妝品審批和監(jiān)督工作。以往發(fā)布的文件要求與本規(guī)范不一致的，以本規(guī)范為準。中華人民共和國衛(wèi)生部印章二○○二年九月十九日

提示：本規(guī)范印刷版權由衛(wèi)生部所有嚴禁單位和個人翻印違者必究提示：本規(guī)范印刷版權由衛(wèi)生部所有嚴禁單位和個人翻印違者必究化妝品衛(wèi)生規(guī)范（二00二年版）衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司編印目錄第一部分總則范圍……………1二、規(guī)范性引用文件………………1三、定義……………1四、化妝品的一般要求……………1五、對產(chǎn)品的要求…………………1六、對原料的要求…………………1七、對包裝的要求…………………2表2（1）化妝品組份中禁用物質（英文排序）…………………3表2（1）化妝品組份中禁用物質（漢語拼音排序）…………15表2（2）化妝品組份中禁用物質（拉丁文排序）………………28表2（2）化妝品組份中禁用物質（漢語拼音排序）……………31表3化妝品組份中限用物質（英文排序）………34表3化妝品組份中限用物質（漢語拼音排序）…………………43表3化妝品組份中限用物質（中文、英文、INCI名稱對照）…………………53表4化妝品組份中限用防腐劑（英文排序）……………………56表4化妝品組份中限用防腐劑（漢語拼音排序）………………61表4化妝品組份中限用防腐劑（中文、英文、INCI名稱對照）…………………66表5化妝品組份中限用紫外線吸收劑（英文排序）……………69表5化妝品組份中限用紫外線吸收劑（漢語拼音排序）………72表5化妝品組份中限用紫外線吸收劑（中文、英文、INCI名稱對照）…………74表6化妝品組份中限用著色劑……………………76第二部分毒理學試驗方法一、總則……………86二、急性經(jīng)口毒性試驗……………87三、急性經(jīng)皮毒性試驗……………90四、皮膚刺激性/腐蝕性試驗……………………93五、急性眼刺激性/腐蝕性試驗…………………96六、皮膚變態(tài)反應試驗…………99七、皮膚光毒性試驗……………104八、鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗………………107九、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗…………114十、體外哺乳動物細胞基因突變試驗……………118十一、哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗………122十二、體內哺乳動物骨髓細胞微核試驗…………125十三、精子畸形試驗………………128十四、亞慢性經(jīng)口毒性試驗………………………131十五、亞慢性經(jīng)皮毒性試驗………………………135十六、致畸試驗……………………139十七、綜合慢性毒性/致癌性試驗………………142第三部分衛(wèi)生化學檢驗方法一、總則……………147二、汞………………149三、砷………………153四、鉛………………161五、甲醇……………167六、微波消解法……………………170七、pH………………172八、鎘………………174九、鍶………………178十、總氟……………180十一、總硒…………………………182十二、硼酸和硼酸鹽………………184十三、去頭屑洗發(fā)用品中二硫化硒………………186十四、甲醛…………………………188十五、巰基乙酸……………………190十六、苯酚、氫醌…………………192十七、性激素………………………197十八、紫外吸收劑…………………201十九、防腐劑………………………208二十、氫化型染發(fā)劑中染料………………………211二十一、氮芥………………………213二十二、斑蝥素……………………215二十三、α-羥基酸………………217第四部分微生物檢驗方法一、總則……………219二、菌落總數(shù)………………………221三、糞大腸菌群……………………224四、綠膿桿菌………………………227五、金黃色葡萄球菌………………230六、霉菌和酵母菌…………………232第五部分人體安全性和功效評價檢驗方法一、總則……………234二、人體斑貼試驗…………………235三、人體試用試驗…………………237四、防曬化妝品防曬指數(shù)（SPF值）人體測定方法…………………240一、總則GeneralPrinciples1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品原料及其產(chǎn)品安全性評價的毒理學檢測項目和要求?；瘖y品原料的檢測化妝品的新原料，一般需進行下列毒理學試驗：急性經(jīng)口和急性經(jīng)皮毒性試驗；皮膚和急性眼刺激性/腐蝕性試驗；皮膚變態(tài)反應試驗；皮膚光毒性和光敏感試驗*（原料具有紫外線吸收特性需做該項試驗）；致突變試驗（至少應包括一項基因突變試驗和一項染色體畸變試驗）；亞慢性經(jīng)口和經(jīng)皮毒性試驗；致畸試驗；慢性毒性/致癌性結合試驗；毒物代謝及動力學試驗*；（10）根據(jù)原料的特性和用途，還可考慮其它必要的試驗。如果該新原料與已用于化妝品的原料化學結構及特性相似，則可考慮減少某些試驗。*試驗方法參照GB7919-87化妝品安全性評價程序和方法OECD化學物質試驗指南(OECDGuidelinesforTestingofChemicals)；3化妝品產(chǎn)品的檢測3.1檢測項目在一般情況下，新開發(fā)的化妝品產(chǎn)品在投放市場前,應根據(jù)產(chǎn)品的用途和類別進行相應的試驗，以評價其安全性。3.2檢測項目的選擇原則3.2.1由于化妝品種類繁多，在選擇試驗項目時應根據(jù)實際情況確定。3.2.2每天使用的化妝品需進行多次皮膚刺激性試驗，進行多次皮膚刺激性試驗者不再進行急性皮膚刺激性試驗間隔數(shù)日使用的和用后沖洗的化妝品進行急性皮膚刺激性試驗。3.2.3與眼接觸可能性小的產(chǎn)品不需進行急性眼刺激性試驗。二、急性經(jīng)口毒性試驗AcuteOralToxicityTest1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物急性經(jīng)口毒性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學檢測。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.401,Feb.1987)USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines（Series870.1100,Aug.1998)3試驗目的急性經(jīng)口毒性試驗是評估化妝品原料毒性特性的第一步，通過短時間經(jīng)口染毒可提供對健康危害的信息。試驗結果可作為化妝品原料毒性分級和標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗和其它毒理學試驗劑量的依據(jù)。4定義4.1急性經(jīng)口毒性(Acuteoraltoxicity)：一次或在24h內多次經(jīng)口給予實驗動物受試物后，動物在短期內出現(xiàn)的健康損害效應。4.2經(jīng)口LD50（半數(shù)致死量，Mediumlethaldose）：經(jīng)口一次給予受試物后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學劑量。以單位體重接受受試物的重量(mg/kg或g/kg)來表示。5試驗的基本原則以管飼法經(jīng)口給予各試驗組動物不同劑量的受試物，每組用一個劑量，染毒劑量的選擇可通過預試驗確定。染毒后觀察動物的毒性反應和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行尸檢，試驗結束時仍存活的動物要處死并進行尸檢。本方法主要適用于嚙齒類動物的研究，但也可用于非嚙齒類動物的研究。6試驗方法6.1受試物受試物應溶解或懸浮于適宜的介質中，建議首選水，其次是植物油(如玉米油)，或考慮使用其它介質（如羧甲基纖維素、明膠、淀粉等）。對非水溶性介質，應了解其毒理特性，否則應在試驗前先確定其毒性。每次經(jīng)口染毒液體的最大容量取決于實驗動物的大小，對嚙齒類動物所給液體容量一般為1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。通過調整受試物溶液濃度使各劑量組經(jīng)口染毒的容量一致。6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康成年大鼠和小鼠，也可選用其它敏感動物。使用雌性動物應是未孕和未曾產(chǎn)仔的。實驗動物體重之間相差不得超過平均體重的20%。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3~5d時間。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。6.3劑量水平根據(jù)所選方法的要求，原則上應設4~6個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試。如果受試物毒性很低，也可采用一次限量法，即用10只動物（雌雄各半）口服5000mg/kg體重劑量，當未引起動物死亡，可考慮不再進行多個劑量的急性經(jīng)口毒性試驗。6.4試驗步驟6.4.1試驗前，實驗動物禁食過夜，不限制飲水。若采用代謝率高的其它動物，禁食時間可以適當縮短。6.4.2正式試驗時，稱量動物體重，隨機分組，然后對各組動物用管飼法一次進行染毒，若估計受試物毒性很低，一次給予容量太大，也可在24h內分2~3次染毒，但合并作為一次劑量計算。染毒后繼續(xù)禁食3h~4h。若采用分批多次染毒，根據(jù)染毒間隔長短，必要時可給動物一定量的食物和水。6.4.3染毒后，對每只動物都應有單獨全面的記錄，染毒第1d要定時觀察實驗動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后至少每天進行一次仔細的檢查。詳細記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時間和死亡時間。6.4.4觀察期限一般不超過14觀察期內存活動物每周稱重，觀察期結束存活動物應稱重，處死后進行尸檢。6.4.5對實驗動物進行大體解剖學檢查，并記錄全部大體病理改變。對死亡和存活6.4.66.5試驗結果評價評價試驗結果時，應將LD50與觀察到的毒性效應和尸檢所見相結合考慮，LD50值是受試物毒性分級和標簽標識以及判定受試物經(jīng)消化道攝入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價應包括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其它毒性作用)的發(fā)生率和嚴重程度之間的關系。毒性分級見表1。7試驗報告試驗報告應包括如下內容:（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；（2）實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；（4）所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；（5）染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見；（6）計算LD50的方法；（7）列表報告結果和計算的LD50及其95%可信區(qū)間（建議的表格形式見表2）；（8）結論。表1經(jīng)口毒性分級LD50(mg/kg)毒性分級≤50高毒>50～500中等毒>500～5000低毒>5000實際無毒表2對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結果動物性別劑量分組（mg/kg）動物數(shù)（只）體重（x±SD）(g)死亡動物數(shù)（只）死亡率（%）0天7天14天LD50及95%可信區(qū)間：雄性動物：雌性動物：8試驗結果的解釋通過急性經(jīng)口毒性試驗和LD50的測定可評價受試物的毒性。其結果外推到人類的有效性很有限。三、急性經(jīng)皮毒性試驗AcuteDermalToxicityTest1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物急性皮膚毒性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料安全性毒理學檢測。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.402,Feb.1987)USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines（Series870.1200，Aug.1998)3試驗目的急性皮膚毒性試驗可確定受試物能否經(jīng)皮膚吸收和短期作用所產(chǎn)生的毒性反應，可為化妝品原料毒性分級和標簽標識以及確定亞慢性毒性試驗和其它毒理學試驗劑量提供依據(jù)。4定義4.1急性皮膚毒性（Acutedermaltoxicity）：經(jīng)皮一次涂敷受試物后，動物在短期內出現(xiàn)的健康損害效應。4.2經(jīng)皮LD50（半數(shù)致死量,Mediumlethaldose）：經(jīng)皮一次涂敷受試物后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學劑量。以單位體重涂敷受試物的重量(mg/kg或g/kg)來表示。5試驗的基本原則受試物以不同劑量經(jīng)皮給予各組實驗動物，每組用一個劑量。染毒后觀察動物的毒性反應和死亡情況。試驗期間死亡的動物要進行尸檢，試驗結束時仍存活的動物要處死并進行尸檢。若已知受試物具有腐蝕性或強刺激性可不進行急性經(jīng)皮毒性試驗。6試驗方法6.1受試物液體受試物一般不需稀釋。若受試物為固體，應研磨成細粉狀，并用適量水或無毒、無刺激性、不影響受試物穿透皮膚、不與受試物反應的介質混勻，以保證受試物與皮膚有良好的接觸。常用的介質有橄欖油、羊毛脂、凡士林等。6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境可選用健康成年大鼠、家兔或豚鼠作為實驗動物，也可使用其它種屬動物進行試驗。使用雌性動物應是未孕和未曾產(chǎn)仔的。建議實驗動物體重范圍為：大鼠200g~300g；家兔2kg~3kg；豚鼠350g~450g。實驗動物皮膚應健康無破損。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3d~5d時間。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。6.３劑量水平根據(jù)所選用的方法要求，原則上應設4~6個劑量組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產(chǎn)生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試。如果受試物毒性很低，可采用一次限量法，即用10只動物（雌雄各半）皮膚涂抹5000mg/kg體重劑量，當未引起動物死亡，可考慮不再進行多個劑量的急性經(jīng)皮毒性試驗。6.4試驗步驟6.4.1試驗開始前24h，剪去或剃除動物軀干背部擬染毒區(qū)域的被毛，去毛時應非常小心，不要損傷皮膚以免影響皮膚的通透性。涂皮面積約占動物體表面積的10%，應根據(jù)動物體重確定涂皮面積。體重為200g~300g的大鼠約為30cm2~40cm2，體重為2kg~3kg的家兔約為160cm2~210cm2,體重為350g~450g6.4.2將受試物均勻涂敷于動物背部皮膚染毒區(qū)，然后用一層薄膠片覆蓋，無刺激膠布固定，防止動物舔食。若受試物毒性較高，可減少涂敷面積，但涂敷仍需盡可能薄而均勻。一般封閉接觸26.4.36.4.4觀察期限一般不超過146.4.5對每只動物都應有單獨全面的記錄，染毒第1d觀察期內存活動物每周稱重、觀察期結束存活動物應稱重，處死后進行尸檢。6.4.6對實驗動物進行大體解剖學檢查，并記錄全部大體病理改變。對死亡和存活246.4.76.5試驗結果評價評價試驗結果時，應將經(jīng)皮LD50與觀察到的毒性效應和尸檢所見相結合考慮，LD50值是受試物毒性分級和標簽標識以及判定受試物經(jīng)皮膚吸收后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等。評價應包括動物接觸受試物與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其它毒性作用）的發(fā)生率和嚴重程度之間的關系。毒性分級見表1。7試驗報告試驗報告應包括如下內容:受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；所用劑量和動物分組，每組所用動物性別、數(shù)量及體重范圍；染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見；計算LD50的方法；列表報告結果和計算LD50及其95%可信區(qū)間（建議的表格形式見表2）；結論。表1皮膚毒性分級LD50(mg/kg)毒性分級≤200高毒>200～2000中等毒>2000～5000低毒>5000實際無毒表2對大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗結果動物性別劑量分組（mg/kg）動物數(shù)（只）體重（x±SD）(g)死亡動物數(shù)（只）死亡率（%）0天7天14天LD50及95%可信區(qū)間：雄性動物：雌性動物：8試驗結果的解釋急性經(jīng)皮毒性試驗研究和經(jīng)皮LD50的確定提供了受試物經(jīng)皮染毒的毒性。其結果外推到人類的有效性很有限。急性經(jīng)皮毒性試驗的結果應與經(jīng)其它途徑染毒的急性毒性試驗結果相結合進行綜合評價。四、皮膚刺激性/腐蝕性試驗DermalIrritation/CorrosionTest1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物皮膚刺激性或腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學檢測。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.404,July1992)USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2500,Aug.1998)3試驗目的確定和評價化妝品原料及其產(chǎn)品對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度。4定義4.1皮膚刺激性(Dermalirritation)：皮膚涂敷受試物后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。4.2皮膚腐蝕性(Dermalcorrosion)：皮膚涂敷受試物后局部引起的不可逆性組織損傷。試驗的基本原則將受試物一次(或多次)涂敷于受試動物的皮膚上，在規(guī)定的時間間隔內，觀察動物皮膚局部刺激作用的程度并進行評分。采用自身對照，以評價受試物對皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗觀察期限應足以評價該作用的可逆性或不可逆性。6試驗方法6.1受試物液體受試物一般不需稀釋，可直接使用原液。若受試物為固體，應將其研磨成細粉狀，并用水或其它無刺激性溶劑充分濕潤，以保證受試物與皮膚有良好的接觸。使用其它溶劑，應考慮到該溶劑對受試物皮膚刺激性的影響。受試物為強酸或強堿（pH值≤2或≥11.5），可以不再進行皮膚刺激試驗。此外，若已知受試物有很強的經(jīng)皮吸收毒性，經(jīng)皮LD50小于200mg/kg體重或在急性經(jīng)皮毒性試驗中受試物劑量為5000mg/kg體重仍未出現(xiàn)皮膚刺激性作用，也無需進行急性皮膚刺激性試驗。6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境多種哺乳動物均可被選為實驗動物，首選白色家兔。應使用成年、健康、皮膚無損傷的動物，雌性和雄性均可，但雌性動物應是未孕和未曾產(chǎn)仔的。實驗動物至少要用4只，如要澄清某些可疑的反應則需增加實驗動物數(shù)。實驗動物應單籠飼養(yǎng)，試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3d時間。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。6.3急性皮膚刺激性試驗步驟6.3.1試驗前約24h，將實驗動物背部脊柱兩側毛剪掉，不可損傷表皮，去毛范圍左、右各約2cm6.3.2取受試物約0.5mL（g）直接涂在皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側皮膚作為對照。采用封閉試驗，敷用時間為4h如懷疑受試物可能引起嚴重刺激或腐蝕作用，可采取分段試驗，將三個涂布受試物的紗布塊同時或先后敷貼在一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗。6.3.3于清除受試物后的1、24、48和72h6.3.4觀察時間的確定應足以觀察到可逆或不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。6.4多次皮膚刺激性試驗步驟6.4.1試驗前將實驗動物背部脊柱兩側被毛剪掉，去毛范圍各為2cm×3cm，涂抹面積2.5cm×6.4.26.4.3表1皮膚刺激反應評分皮膚反應積分紅斑和焦痂形成無紅斑0輕微紅斑（勉強可見）1明顯紅斑2中度~重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫（勉強可見）1輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2中度水腫（皮膚隆起約1mm3重度水腫（皮膚隆起超過1mm4最高積分87試驗報告試驗報告應以表格形式總結，包括如下內容：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量。必要時說明受試物的pH值；實驗動物的種屬、品系、性別、體重和來源（注明合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；每個動物在每一觀察時點的皮膚刺激反應積分；具體描述除刺激性以外的其它毒性作用；結論。表2皮膚刺激強度分級積分均值強度0~＜0.5無刺激性0.5~＜2.0輕刺激性2.0~＜6.0中刺激性6.0~8.0強刺激性表3×××對家兔急性皮膚刺激性試驗結果動物編號性別體重(kg)1h24h48h72h樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分紅斑水腫總分1234總積分均值刺激強度分級表4×××對家兔多次皮膚刺激性試驗結果涂抹天數(shù)動物數(shù)(只)刺激反應積分樣品對照紅斑水腫總分紅斑水腫總分14243444546474849410411412413414414天每只動物積分均值每天每只動物積分均值8試驗結果的解釋急性皮膚刺激試驗結果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結果，則會增加從動物外推到人的可靠性。試驗中使用封閉式接觸是一種超常的實驗室條件下的試驗，在人類實際使用化妝品過程中很少存在這種接觸方式。五、急性眼刺激性/腐蝕性試驗AcuteEyeIrritation/CorrosionTest1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物急性眼刺激性或腐蝕性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學檢測。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No405,Feb.1987)USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2400,Aug.1998)3試驗目的確定和評價化妝品原料及其產(chǎn)品對哺乳動物的眼睛是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度。4定義4.1眼睛刺激性(Eyeirritation)：眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。4.2眼睛腐蝕性(Eyecorrosion)：眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。5試驗的基本原則受試物以一次劑量滴入每只實驗動物的一側眼睛結膜囊內，以未作處理的另一側眼睛作為自身對照。在規(guī)定的時間間隔內，觀察對動物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評分，以此評價受試物對眼睛的刺激作用。觀察期限應能足以評價刺激效應的可逆性或不可逆性。試驗方法6.1受試物液體受試物一般不需稀釋,可直接使用原液，染毒量為0.1mL。若受試物為固體或顆粒狀，應將其研磨成細粉狀，并用水充分濕潤,染毒量應為體積0.1mL或重量不大于100mg（染毒量應進行記錄）。受試物為強酸或強堿（pH值≤2或≥11.5），或已證實對皮膚有腐蝕性或強刺激性時，可以不再進行眼刺激性試驗。氣溶膠產(chǎn)品需噴至容器中，收集其液體再使用。6.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境首選健康成年白色家兔。至少使用3只家兔。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3d時間。在試驗開始前的24h內要對試驗動物的兩只眼睛進行檢查（包括使用熒光素鈉檢查）。有眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結膜損傷的動物不能用于試驗。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。6.3試驗步驟6.3.1輕輕拉開家兔一側眼睛的下眼瞼，將受試物0.1mL（100mg）滴入(或涂入)結膜囊中，使上、下眼瞼被動閉合1s，以防止受試物丟失。另一側眼睛不處理作自身對照。滴入受試物后6.3.2若上述試驗結果顯示受試物有刺激性，需另選用3只家兔進行沖洗效果試驗，即給家兔眼滴入受試物后6.3.3臨床檢查和評分：在滴入受試物后1、24、48、72h以及第4d和第7d對動物眼睛進行檢查。如果72h未出現(xiàn)刺激反應，即可終止試驗。如果發(fā)現(xiàn)累及角膜或有其它眼刺激作用，7可使用放大鏡、手持裂隙燈、生物顯微鏡或其它適用的儀器設備進行眼刺激反應檢查。在24h觀察和記錄結束之后，對所有動物的眼睛應用熒光素鈉作進一步檢查6.3.4對用后沖洗的產(chǎn)品（如洗面奶、發(fā)用品）只做30s沖洗試驗，即滴入受試物后，眼閉合1s，至第30s時用足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的水流沖洗30s表1眼損害的評分標準眼損害積分角膜：混濁（以最致密部位為準）無潰瘍形成或混濁散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細節(jié)不清，瞳孔大小勉強可見角膜混濁，虹膜無法辨認01234虹膜：正常皺褶明顯加深，充血、腫脹、角膜周圍有中度充血，瞳孔對光仍有反應出血、肉眼可見破壞，對光無反應（或出現(xiàn)其中之一反應）012結膜：充血（指瞼結膜、球結膜部位）血管正常血管充血呈鮮紅色血管充血呈深紅色，血管不易分辨彌漫性充血呈紫紅色水腫無輕微水腫（包括瞬膜）明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻水腫至眼瞼近半閉合水腫至眼瞼大半閉合0123012347結果評價化妝品原料—以給受試物后動物角膜、虹膜或結膜各自在24、48和72h觀察時點的刺激反應積分的均值和恢復時間評價，按表2眼刺激反應分級判定受試物對眼的刺激強度。化妝品產(chǎn)品—以給受試物后動物角膜、虹膜或結膜各自在24、48或72h觀察時點的刺激反應的最高積分和恢復時間評價，按表3眼刺激反應分級判定受試物對眼的刺激強度。8試驗報告試驗報告應包括如下內容：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量，必要時說明受試物的pH值；實驗動物的種屬、品系和來源（注明合格證號和動物級別）；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；列表顯示每只動物在每一觀察時點（如染毒1，24，48和72h）的刺激反應（建議的表格形式見表4），將實驗條件不沖洗和30秒沖洗的結果分別列表；具體描述除眼部以外的其它作用；描述在各觀察時點積分時的檢查方法（如手持裂隙燈、用熒光素鈉）；結論。表2眼刺激性反應分級可逆眼損傷2A級（輕刺激性）2/3動物的刺激反應積分均值：角膜渾濁≥1；虹膜≥1；結膜充血≥2；結膜水腫≥2和上述刺激反應積分在≤7天完全恢復2B級（刺激性）2/3動物的刺激反應積分均值：角膜渾濁≥1；虹膜≥1；結膜充血≥2；結膜水腫≥2和上述刺激反應積分在＜21天完全恢復不可逆眼損傷任1只動物的角膜、虹膜和/或結膜刺激反應積分在21天的觀察期間沒有完全恢復2/3動物的刺激反應積分均值：角膜渾濁≥3和/或虹膜＞1.5表3眼刺激性反應分級可逆眼損傷微刺激性動物的角膜、虹膜積分=0；結膜充血或結膜水腫積分≤2，且積分在＜7天內降至0輕刺激性動物的角膜、虹膜、結膜積分在≤7天降至0刺激性動物的角膜、虹膜、結膜積分在8～21天內降至0不可逆眼損傷腐蝕性①動物的角膜、虹膜和/或結膜積分在第21天時＞0；②2/3動物的眼刺激反應積分：角膜渾濁≥3和/或虹膜=2注：當角膜、虹膜、結膜積分為0時，可判為無刺激性。表4表4對家兔眼睛刺激性試驗結果實驗條件：不沖洗30秒沖洗動物編號部位眼刺激性反應積分1h24h48h72h4d7d樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照樣品對照1結膜虹膜角膜2結膜虹膜角膜3結膜虹膜角膜刺激反應分級9．試驗結果的解釋急性眼刺激性試驗結果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結果，則會增加從動物外推到人的可靠性。六、皮膚變態(tài)反應試驗SkinSensitisationTest1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物皮膚變態(tài)反應試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學檢測。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No406,July1992)USEPAOPPTSHarmonizedTestGuidelines(Series870.2600,Aug.1998)3試驗目的確定重復接觸化妝品及其原料對哺乳動物是否可引起變態(tài)反應及其程度。4定義4.1皮膚變態(tài)反應（過敏性接觸性皮炎）（Skinsensitization，allergiccontactdermatitis）是皮膚對一種物質產(chǎn)生的免疫源性皮膚反應。在人類這種反應可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反應不同，可能只見到皮膚紅斑和水腫。4.2誘導接觸(Inductionexposure)指機體通過接觸受試物而誘導出過敏狀態(tài)的試驗性暴露。4.3誘導階段(Inductionperiod)指機體通過接觸受試物而誘導出過敏狀態(tài)所需的時間，一般至少一周。4.4激發(fā)接觸(Challengeexposure)機體接受誘導暴露后，再次接觸受試物的試驗性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反應。5試驗的基本原則實驗動物通過多次皮膚涂抹（誘導接觸）或皮內注射受試物10d~14d（誘導階段）后，給予激發(fā)劑量的受試物，觀察實驗動物并與對照動物比較對激發(fā)接觸受試物的皮膚反應強度。5.1實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境一般選用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性動物應選用未孕或未曾產(chǎn)仔的。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制，需注意補充適量Vc。5.2動物試驗前準備試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3d~5d時間。將動物隨機分為受試物組和對照組，按所選用的試驗方法，選擇適當部位給動物備皮（去毛），避免損傷皮膚。試驗開始和結束時應記錄動物體重。5.3無論在誘導階段或激發(fā)階段均應對動物進行全面觀察包括全身反應和局部反應，并作完整記錄。5.4試驗方法可靠性的檢查使用已知的能引起輕度/中度致敏的陽性物每隔半年檢查一次。局部封閉涂皮法至少有30%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應；皮內注射法至少有60%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應。陽性物一般采用2,4-二硝基氯代苯，肉桂醛，2-巰基苯并噻唑或對氨基苯酸乙酯。6試驗方法6.1局部封閉涂皮試驗（BuehlerTest,BT）6.1.1動物數(shù)試驗組至少20只，對照組至少10只。6.1.2劑量水平誘導接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應的最高濃度。試驗濃度水平可以通過少量動物（2~3只）的預試驗獲得。水溶性受試物可用水或用無刺激性表面活性劑作為賦形劑，其它受試物可用80%乙醇（誘導接觸）或丙酮（激發(fā)接觸）作賦形劑。6.1.3試驗步驟6.1.3.1試驗前約24h，將豚鼠背部左側去毛，去毛范圍為4cm2~6cm26.1.3.2誘導接觸：將受試物約0.2mL（g）涂在實驗動物去毛區(qū)皮膚上，以二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠布封閉固定6h。第7d和第14d以同樣方法重復一次。6.1.3.3激發(fā)接觸：末次誘導后14~28d，將約0.2mL的受試物涂于豚鼠背部右側2cm×2cm去毛區(qū)（接觸前24h脫毛），然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠布固定66.1.3.4激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應，按表1評分。6.1.3.5試驗中需設陰性對照組，使用6.1.3.2和6.1.3.3的方法，在誘導接觸時僅涂以溶劑作為對照，在激發(fā)接觸時涂以受試物。對照組動物必須和受試物組動物為同一批。在實驗室開展變態(tài)反應試驗初期，或使用新的動物種屬或品系時，需同時設陽性對照組。表1變態(tài)反應試驗皮膚反應評分皮膚反應積分紅斑和焦痂形成無紅斑0輕微紅斑（勉強可見）1明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2中度~重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫（勉強可見）1中度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2重度水腫（皮膚隆起約1mm或超過13最高積分76.1.46.1.4.1當受試物組動物出現(xiàn)皮膚反應積分≥6.1.4.2如激發(fā)接觸所得結果仍不能確定，應于第一次激發(fā)后一周，給予第二次激發(fā)，對照組作同步處理或按6.2的方法進行評價6.2豚鼠最大值試驗(GuineaPigMaximinatimTest,GPMT)采用完全福氏佐劑(FreundCompleteAdjvant,FCA)皮內注射方法檢測致敏的可能性。6.2.1動物數(shù)試驗組至少用10只，對照組至少5只。如果試驗結果難以確定受試物的致敏性，應增加動物數(shù)，試驗組20只，對照組10只。6.2.2劑量水平誘導接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應的最高濃度。試驗濃度水平可以通過少量動物（2~3只）的預試驗獲得。6.2.3試驗步驟6.2.3.1誘導接觸（第0d）受試物組：將頸背部去毛區(qū)（2cm×4cm）中線兩側劃定三個對稱點，每點皮內注射第1點1：1（V/V）FCA/水或生理鹽水的混合物第2點耐受濃度的受試物第3點用1：1（v/v）FAC/水或生理鹽水配制的受試物，濃度與第2點相同對照組：注射部位同受試物組第1點1：1（V/V）FCA/水或生理鹽水的混合物第2點未稀釋的溶劑第3點用1：1（v/v）FAC/水或生理鹽水配制的濃度為50%（w/v）的溶劑6.2.3.2誘導接觸（第7d）：將涂有0.5g(mL)受試物的2cm×4cm濾紙敷貼在上述再次去毛的注射部位，然后用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定48h。對無皮膚刺激作用的受試物，可加強致敏，于第二次誘導接觸前24h在注射部位涂抹10%十二烷基硫酸鈉（SLS）6.2.3.3激發(fā)接觸（第21d）將豚鼠軀干部去毛，用涂有0.5g(mL)受試物的2cm×2cm濾紙片敷貼在去毛區(qū)，然后再用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定24h。對照組動物作同樣處理。如激發(fā)接觸所得結果不能確定，可在第一次激發(fā)接觸一周后進行第二次激發(fā)接觸。對照組作同步處理。6.2.4觀察及結果評價激發(fā)接觸結束，除去涂有受試物的濾紙后24、48和72h，觀察皮膚反應，（如需要清除受試殘留物可用水或選用不改變皮膚已有反應和不損傷皮膚的溶劑）按表2評分。當受試物組動物皮膚反應積分≥1時，應判為變態(tài)反應陽性，按表3對受試物進行致敏強度分級。表2變態(tài)反應試驗皮膚反應評分0=未見皮膚反應1=散在或小塊紅斑2=中度紅斑和融合紅斑3=重度紅斑和水腫表3致敏強度致敏率%致敏強度0~8弱9~28輕29~64中65~80強81~100極強注：當致敏率為0時，可判為未見皮膚變態(tài)反應。7試驗報告報告應包括如下內容：受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；實驗動物的種屬、品系、來源（注明合格證號和動物級別）、性別、數(shù)量；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；試驗方法；試驗開始和結束時動物體重；結果：以表格形式報告各組動物皮膚反應情況和致敏率等（建議的表格形式見表4、5）；結論。表4對豚鼠皮膚變態(tài)反應試驗結果(BT法)組別動物數(shù)誘導劑量激發(fā)劑量觀察時間(h)皮膚反應強度≥2的動物數(shù)%紅斑水腫012340123陰性24對照48受試24物組48陽性24對照48注：在皮膚反應強度欄中應填寫當皮膚反應積分為0、1、2、3...時，發(fā)生反應的動物數(shù)占受試動物數(shù)的比例，陽性對照試驗日期：表5對豚鼠皮膚變態(tài)反應試驗結果（GPMT法）組別動物數(shù)誘導劑量激發(fā)劑量觀察時間(h)皮膚反應強度≥1的動物數(shù)%0123陰性24244872244872244872對照受試物組陽性對照注：在皮膚反應強度欄中應填寫當皮膚反應積分為0、1、2、3時，發(fā)生反應的動物數(shù)占受試動物數(shù)的比例，陽性對照試驗日期：8試驗結果的解釋試驗結果應能得出受試物的致敏能力和強度。這些結果只能在很有限的范圍內外推到人類。引起豚鼠強烈反應的物質在人群中也可能引起一定程度的變態(tài)反應，而引起豚鼠較弱反應的物質在人群中也許不能引起變態(tài)反應。七、皮膚光毒性試驗SkinPhototoxicityTest范圍本規(guī)范規(guī)定了皮膚光毒性試驗的基本原則，要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學檢測。2試驗目的評價化妝品原料及其產(chǎn)品引起皮膚光毒性的可能性。3定義光毒性（Phototoxicity）：皮膚一次接觸化學物質后，繼而暴露于紫外線照射下所引發(fā)的一種皮膚毒性反應，或者全身應用化學物質后，暴露于紫外線照射下發(fā)生的類似反應。4試驗的基本原則將一定量受試物涂抹在動物背部去毛的皮膚上，經(jīng)一定時間間隔后暴露于UVA光線下，觀察受試動物皮膚反應并確定該受試物有否光毒性。5試驗方法5.1受試物液體受試物一般不用稀釋，可直接使用原液。若受試物為固體，應將其研磨成細粉狀并用水或其它溶劑充分濕潤，在使用溶劑時，應考慮到溶劑對受試動物皮膚刺激性的影響。對于化妝品產(chǎn)品而言，一般使用原霜或原液。陽性對照物選用8-甲氧基補骨脂（8-methoxypsoralen，8-Mop）。5.2實驗動物和飼養(yǎng)條件使用成年白色家兔或白化豚鼠，盡可能雌雄各半。選用6只動物進行正式試驗。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3d~5d時間。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制，需注意補充適量Vc。5.3UV光源5.3.1UV光源：波長為320nm~400nm的UVA，如含有UVB，其劑量不得超過0.1J/cm2PAGE\#"'Page:'#'

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'"5.3.2強度的測定：用前需用輻射計量儀在實驗動物背部照射區(qū)設6個點測定光強度（mw/cm25.3.3照射時間的計算：照射劑量為10J/cm2，按下式計算照射時間。注：1mw/cm2=1mJ/cm2/sec5.4試驗步驟5.4.1進行正式光毒試驗前18h~24h，將動物脊柱兩側皮膚去毛，試驗部位皮膚需完好，無損傷及異常。備4塊去毛區(qū)（見圖1），每塊去毛面積約為2cm×2cm5.4.2將動物固定，按表1所示，在動物去毛區(qū)1和2涂敷0.2mL(g)濃度不能引起皮膚刺激反應(可通過預試驗確定)，30min后，左側（去毛區(qū)1和3）用鋁箔復蓋，膠帶固定，右側用UVA進行照射。5.4.3結束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應，根據(jù)表2判定每只動物皮膚反應評分。5.4.4為保證試驗方法的可靠性，至少每半年用陽性對照物檢查一次。即在去毛區(qū)1和2涂陽性對照物，方法同5.4.圖1動物皮膚去毛區(qū)位置示意圖表1動物去毛區(qū)的試驗安排去毛區(qū)編號試驗處理1涂受試物，不照射2涂受試物，照射3不涂受試物，不照射4不涂受試物，照射表2皮膚刺激反應評分皮膚反應積分紅斑和焦痂形成無紅斑0輕微紅斑（勉強可見）1明顯紅斑2中度~重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫（勉強可見）1輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2中度水腫（皮膚隆起約1mm3重度水腫（皮膚隆起超過1mm4最高積分86結果評價單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應分值之和為2或2以上的動物數(shù)為1只或1只以上時，判為受試物具有光毒性。7試驗報告報告應包括下列內容：（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度；（2）動物種屬、品系、性別、體重、來源（注明合格證號和動物級別）；（3）實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；（4）光源的生產(chǎn)廠、規(guī)格；（5）光強度和照射時間以及試驗方法；（6）結果：以列表方式報告動物出現(xiàn)皮膚反應的積分（見表3和表4）；（7）結論。表3×××對豚鼠皮膚光毒性試驗結果動物編號性別體重(g)皮膚反應積分1h123424h123448h123472h1234123456注：1，2，3，4為表1所示試驗區(qū)。表4陽性對照物對豚鼠皮膚光毒性試驗結果動物編號性別體重(g)皮膚反應積分1h123424h123448h123472h1234123456注：1，2，3，4為表1所示試驗區(qū)。實驗日期：SalmonellaTyphimurium/ReverseMutationAssay1范圍本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復突變試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.471,Adopted:21,July1997)。3定義3.1回復突變（Reversemutation）細菌在化學致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。3.2基因突變（Genemutation）在化學致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。3.3堿基置換突變（Basesubstitutionmutation）引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。堿基置換有轉換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。3.4移碼突變（Frameshiftmutation）引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。3.5鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗（Salmonellatyphimurium/reversemutationassay）利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復突變的試驗方法。3.6S9經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。4原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變，故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。5儀器和設備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g6培養(yǎng)基和試劑6.10.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-組氨酸(MW155) 78mgD-生物素(MW244) 122mg加蒸餾水至 1000mL配6.2頂層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉 1.2g氯化鈉 1.0g加蒸餾水至 200mL配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。6.3Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g磷酸氫二鉀(K2HPO4) 500g磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 175g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 10g加蒸餾水至 1000mL配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃6.420%葡萄糖溶液成分：葡萄糖 200g加蒸餾水至 1000mL0.068MPa下6.5底層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉 7.5g蒸餾水 480mLV-B培養(yǎng)基E 10mL20%葡萄糖溶液 10mL配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h6.6營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基成分：牛肉膏 2.5g胰胨 5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g加蒸餾水至 500mL配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃6.7鹽溶液(1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2)成分：氯化鉀(KCl) 61.5g氯化鎂(MgCl2·6H2O) 40.7g加蒸餾水至 500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃6.80.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.965g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 29.015g加蒸餾水至 500mL配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃6.9S9混合液成分 每毫升S9混合液肝S9 100鹽溶液 20滅菌蒸餾水 3800.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500輔酶II(NADP) 4mol6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mol配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結束，剩余S9混合液應該丟棄。6.10菌株鑒定用和特殊用途試劑6.10.1組氨酸—生物素平板成分：瓊脂粉 15g蒸餾水 944mL(V-B)培養(yǎng)基E 20mL20%葡萄糖 20mL滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進熱的瓊脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。6.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板成分：瓊脂粉 15蒸餾水 940mL(V-B)鹽溶液 20mL20%葡萄糖 20mL滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/LHCl中) 0.25mL配制：應該在傾注瓊脂平板后幾天內，制備主平板。6.10.3營養(yǎng)瓊脂平板成份：瓊脂粉 7.5g營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。7試驗菌株及其生物學特性鑒定7.1試驗菌株采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標準測試菌株。7.2生物學特性鑒定新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標準，如表1所示。表1試驗菌株鑒定的判斷標準菌株組氨酸缺陷脂多糖屏障缺損氨芐青霉素抗性切除修復缺損四環(huán)素抗性自發(fā)回變菌落數(shù)*TA97TA98TA100TA102++++++++++++++++90-18030-50100-200240-320注“+”表示需要組氨酸“+”表示具有rfa突變“+”表示具有R因子“+”表示具有△uvrB突變“+”表示具有pAQ1質粒*在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增7.2.1組氨酸缺陷原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37℃結果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長。7.2.2脂多糖屏障缺損原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質如結晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃結果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。7.2.3氨芐青霉素抗性原理：含R因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質粒存在與否。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃結果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。7.2.4紫外線敏感性原理：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃結果判斷：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細菌不生長，而具有完整的切除修復系統(tǒng)的菌株，則照常生長。7.2.5四環(huán)素抗性原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃結果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質粒。7.2.6自發(fā)回變原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸—生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃培養(yǎng)箱中結果判斷：每種標準測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。7.2.7回變特性—診斷性試驗原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質以及S9混合液的效應不一。鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進行。將受試物換成診斷性誘變劑。結果判斷：標準菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結果參見表2。表2測試菌株的回變性誘變劑劑量(g)S9TA97TA98TA100TA102柔毛霉素疊氮化鈉ICR—191鏈霉黑素絲裂霉素C2,4,7-三硝基-9-芴酮4-硝基-O-次苯二胺4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯2-氨基芴苯并（a）芘6.01.51.00.250.50.20200.51.0101.0++124761640inhinh8377216052817417423373123363inhinh82441599292236194143473000185inhinh4007984220273030269375921880223027721602876586261255注：inh表示抑菌。表中數(shù)值均已扣除溶劑對照回變菌落數(shù)。8大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的制備8.1誘導最廣泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結合也可做為誘導劑。S9制備動物誘導后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2mL~3mL。儲存于液氮生物容器中或-80上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S9所用一切手術器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。9溶劑的選擇如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為10010劑量的設計決定受試物最高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細菌存活數(shù)減少，都是毒性的標志。對原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應設四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。11試驗操作步驟11.1增菌培養(yǎng)取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應每毫升不少于1～2×10911.2平板摻入法實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37實驗中，除設受試物各劑量組外，還應同時設空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。12數(shù)據(jù)處理和結果判斷記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標準差。如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應關系者，則該受試物判定為致突變陽性。受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。13試驗報告試驗報告應包括以下內容：（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；（2）試驗菌株：所用試驗菌株；（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導劑；（4）試驗方法：簡述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應說明空白對照、溶劑對照和陽性對照，陽性結果判定標準；（5）結果：以列表方式報告受試物的Ames實驗結果（表1）；（6）結論。表1Ames試驗菌株的回變結果（平均值±標準差）組別劑量(mg/皿)TA97-(S9)+(S9)TA98-(S9)+(S9)TA100-(S9)+(S9)TA102-(S9)+(S9)受試物自發(fā)回變溶劑對照陽性物對照九、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗InVitroMammalianCellsChromosomeAberrationTest1范圍本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.473,July1997)試驗目的本試驗是用于檢測培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。4定義染色體型畸變(Chromosome-typeaberration)：染色體結構損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體相同位點均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。染色單體型畸變(Chromatid-typeaberration)：染色體結構損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。染色體數(shù)目改變(Numericalaberration)：所用細胞株的正常染色體數(shù)目的變化。結構畸變(Structuralaberration)：在細胞分裂的中期相階段，用顯微鏡檢出的染色體結構改變，表現(xiàn)為缺失、斷片、互換等。有絲分裂指數(shù)(Mitotic