旱獺源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR方法編制說明

1旱獺源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR法編制說明一、項(xiàng)目來源根據(jù)《下達(dá)的2018年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)修制定項(xiàng)目計(jì)劃的通知》內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函〔2018〕154號(hào)，編號(hào)為209、題目為“旱獺源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR方法”的計(jì)劃任務(wù)，二連海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)知識(shí)的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組。起草單位：二連海關(guān)技術(shù)中心，主要起草人：王伊琴、陳少博、包勇敢、楊帆、荊文魁、張志峰、常鴻、趙治國。二、項(xiàng)目的意義和必要性鼠疫(Pestis)是由耶爾森菌引起的自然疫源性人畜共患病，一種高傳播性、高致病性、高死亡率的烈性病菌。傳染源主要是嚙齒動(dòng)物其中以黃鼠屬和旱獺屬最為重要。旱獺作為鼠疫桿菌的宿主動(dòng)物，在鼠疫保存和傳播環(huán)節(jié)上起重要作用，國內(nèi)外都有捕獵旱獺而感染鼠疫或在販運(yùn)的旱獺體內(nèi)分離出鼠疫桿菌的報(bào)道。1926年，伍連德研究證實(shí)，滿洲里地區(qū)的蒙古旱獺是1910、1920年東北肺鼠疫大流行的傳染源。在清末的時(shí)候旱獺皮毛成為了世界皮革市場上的新寵，在利益的驅(qū)使下，中俄商人及地方官員大量招募闖關(guān)東的難民瘋狂的獵殺旱獺。2在這一過程中，因?yàn)槔娴尿?qū)使以及大量新手對(duì)旱獺患病與否不能正確的分辨，于是有人在獵捕的過程中被感染了鼠疫，發(fā)生了記入史冊的肺鼠疫大流行，其感染方式為獵捕旱獺。蒙古國約有40％的土地為鼠疫自然疫源地，其中大部分為活動(dòng)性疫源地，對(duì)人群感染鼠疫具有潛在的危險(xiǎn)性。鼠疫的主要宿主旱獺幾乎遍布蒙古國各地，而且數(shù)量多，是蒙古國的主要狩獵經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，每年約捕獲1200萬只。旱獺（PrairieMarmots）又名土撥鼠，是野生的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，毛皮珍貴，它漂亮的皮毛幾乎可與水獺媲美，其肉鮮美，除了食用外，具有藥用價(jià)值。內(nèi)蒙古對(duì)蒙古國開放口岸，攜帶、偷運(yùn)、販賣旱獺皮的情況時(shí)有發(fā)生，僅2017年發(fā)生兩起較大偷運(yùn)走私案，7月3日，呼和浩特海關(guān)在甘其毛都口岸查獲走私旱獺皮2195張。12月6日，內(nèi)蒙古公安邊防總隊(duì)二連邊防檢查站官兵例行檢查時(shí)，查獲一起走私旱獺皮300張。攜帶、偷運(yùn)、販賣旱獺皮的經(jīng)常發(fā)生，增加了人與早獺接觸和感染鼠疫的機(jī)會(huì)，時(shí)刻威脅我國公共衛(wèi)生安全。這就要求我們在進(jìn)出口動(dòng)物及其制品中準(zhǔn)確甄別動(dòng)物源性，維護(hù)公共生物安全體系，從源頭上打擊攜帶、偷運(yùn)、販賣旱獺皮行為，建立快速、準(zhǔn)確的旱獺源性成分的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。因此，我們特申請此項(xiàng)制標(biāo)任務(wù)。我國動(dòng)物源性成分的檢測體系已經(jīng)日臻完善，包括牛、羊、3豬、雞等家畜家禽源性檢測標(biāo)準(zhǔn)（國標(biāo)或行標(biāo)）已經(jīng)實(shí)施，以及林麝、穿山甲等野生動(dòng)物源性的檢測標(biāo)準(zhǔn)制定已經(jīng)立項(xiàng)。黃羊源性成分檢測方法、草原狼源性成分檢測方法標(biāo)準(zhǔn)率先以內(nèi)蒙古的地標(biāo)立項(xiàng)、研制，而旱獺源性成分的檢測方法目前還是空白，無國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)做為施檢依據(jù)。旱獺資源是我們內(nèi)蒙古特有的野生動(dòng)物資源之一，急需申請制定該我們申請制訂“旱獺源性成分檢測方法-實(shí)時(shí)熒光PCR方法”標(biāo)準(zhǔn)，將為走私販賣旱獺皮毛或其肉制品的鑒定（蒙古旱獺源性成分鑒定）的提供了強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。三、標(biāo)準(zhǔn)的起草過程3.1前期工作項(xiàng)目申請人以及參加人員擁有豐富的科研經(jīng)歷，在動(dòng)物疫病以及動(dòng)物源性成分研究領(lǐng)域具備相應(yīng)的學(xué)科專業(yè)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)操作技能，能夠順利實(shí)施和完成本項(xiàng)目。項(xiàng)目主持人在動(dòng)物源性成分檢測方面開展了大量的工作，積累了較多的經(jīng)驗(yàn)，作為野生動(dòng)物源性成分檢測系列地方標(biāo)準(zhǔn)之一的“黃羊源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光PCR方法”已經(jīng)成功發(fā)布（DB15/1847-2020）。應(yīng)用普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開展檢測鑒定及定量方法；并在動(dòng)物基因多態(tài)性方面取得重大突破，并且在朊蛋白基因多態(tài)性方面以第一作者發(fā)表了2篇SCI文章。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測動(dòng)物源性成分有技術(shù)優(yōu)4項(xiàng)目承擔(dān)單位動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室是區(qū)域性中心實(shí)驗(yàn)室，負(fù)責(zé)本地區(qū)及二連口岸檢疫性動(dòng)物疫病檢驗(yàn)檢疫?，F(xiàn)有儀器設(shè)備共計(jì)100多臺(tái)套，價(jià)值1000多萬元人民幣。目前，實(shí)驗(yàn)室所購置的儀器設(shè)備按照自動(dòng)化、高效化、標(biāo)準(zhǔn)化、高精度化等方向的要求配置，力爭達(dá)到國內(nèi)先進(jìn)水平。儀器設(shè)備包括BioRad凝膠成像系統(tǒng)、DNA凝膠電泳系統(tǒng)、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、低溫培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)、生物安全柜、酶標(biāo)儀、液氮罐、基因擴(kuò)增儀、7500熒光定量PCR儀、全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)、全自動(dòng)基因測序儀等。目前已經(jīng)構(gòu)建了畜禽疫病分子生物學(xué)快速檢測平臺(tái)、動(dòng)物源性成分檢測平臺(tái)。具備開展本項(xiàng)目的硬件設(shè)施條件。承擔(dān)單位組織保障措施：承擔(dān)單位二連海關(guān)技術(shù)中心發(fā)揮組織作用，通過有效的協(xié)調(diào)和管理，調(diào)動(dòng)本單位和參加單位的有效資源，形成對(duì)項(xiàng)目強(qiáng)有力的支持。通過組織優(yōu)秀的研究隊(duì)伍，并通過中期總結(jié)會(huì)、專家研討會(huì)等形式督促項(xiàng)目研究工作的順利完成。3.2制訂起草計(jì)劃，形成征求意見稿編寫了內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目建議書，申請制標(biāo)計(jì)劃。項(xiàng)目獲批后，制定工作思路和技術(shù)路線。同時(shí)制定了標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)劃和安排。3.2.1根據(jù)試驗(yàn)研究，起草“旱獺源性成分檢測方法實(shí)5時(shí)熒光PCR方法”草案。2018.10-12月；四、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》和GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)則編寫。還參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)編寫指南的要求。五、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的研究5.1標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性5.1.1旱獺目的基因序列的比對(duì)選擇線粒體(mtDNA)細(xì)胞色素b(Cytb)基因，經(jīng)過序列比對(duì)，選擇高度保守的片段做為目的片段。5.1.2標(biāo)準(zhǔn)方法的特異性試驗(yàn)以同種方法提取等量的兔、綿羊、鼠、牛、鴨、豬、雞、狼、駱駝、山羊、馬、旱獺DNA和水（空白對(duì)照）為模版，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，檢測其特異性。5.1.3標(biāo)準(zhǔn)方法的靈敏性試驗(yàn)從旱獺組織提取的DNA做10倍的系列稀釋，分別進(jìn)行熒光PCR試驗(yàn)，取6個(gè)梯度的NDA濃度，以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)對(duì)數(shù)與Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.1.4標(biāo)準(zhǔn)方法的重復(fù)性試驗(yàn)從旱獺組織提取的DNA做10倍系列稀釋，取100-10-5稀釋6DNA模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，共進(jìn)行3次試驗(yàn)，計(jì)算批內(nèi)和批間Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。5.2標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性：適用食品、飼料及動(dòng)物組織中旱獺源性成分的檢測鑒定，采用的實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-TimePCR）方法。從DNA水平進(jìn)行動(dòng)物源性的檢測方法包括普通PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-TimePCR）、DNA探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性擴(kuò)增（PCR-RFLP）等方法。前兩種較為常用，而PCR-電泳方法在種源鑒定中應(yīng)用較多，與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相比，其儀器試劑檢測成本較低，但PCR產(chǎn)物需要做凝膠電泳分析，自動(dòng)化程度低易交叉污染造成假陽性結(jié)果，不能滿足批量、快速、定量檢測需要，因此，以特異性好、靈敏性高引物探針設(shè)計(jì)策略已逐步成為肉類及其產(chǎn)品種類鑒別的主要方法。5.3標(biāo)準(zhǔn)的可行性：該方法在人、機(jī)、料、法、環(huán)等各方面因素具備的條件下均易實(shí)現(xiàn)。具體說就是具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的技術(shù)人員的配備、熒光PCR儀、實(shí)驗(yàn)材料是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料、方法是特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好的熒光PCR方法、和具有分子生物學(xué)檢測的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境均可滿足實(shí)施該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測條件。5.4標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照的確定采用已知含有旱獺源性成分的樣品，或經(jīng)測序的陽性質(zhì)粒。六、方法驗(yàn)證7為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，選擇3家相關(guān)科研或檢測機(jī)構(gòu)，對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容為方法的特異性和敏感性。3家驗(yàn)證單位進(jìn)行熒光PCR法驗(yàn)證結(jié)果均符合相關(guān)樣品實(shí)際情況。七.重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果無八.國內(nèi)外情況簡要說明動(dòng)物源性的檢測體系已經(jīng)日臻完善，包括牛、羊、豬、雞等家畜家禽標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)實(shí)施，以及林麝、穿山甲等野生動(dòng)物源性的檢測行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定已經(jīng)立項(xiàng)?！包S羊源性成分檢測實(shí)時(shí)熒光測方法標(biāo)準(zhǔn)（申報(bào)國家發(fā)明專利、延期審定）率先以內(nèi)蒙古的地標(biāo)立項(xiàng)、研制，國內(nèi)外旱獺源性成分檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)目前還是空白，尚無國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或地方標(biāo)準(zhǔn)。旱獺源性成分檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)目前還是空白，無國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)作為施檢依據(jù)。旱獺資源是我們內(nèi)蒙古特有的野生動(dòng)物資源之一，也是鼠疫重要的易感動(dòng)物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項(xiàng)研究，因此，急需申請制定該標(biāo)準(zhǔn)。申請制訂“旱獺源性成分檢測-實(shí)時(shí)熒光PCR法”標(biāo)準(zhǔn)，將為走私販賣旱獺肉或其制品的鑒定（旱獺源性成分鑒定）的提供了強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。8九.結(jié)論綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過程中所涉及到的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，并切實(shí)可行，完全達(dá)到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要十.標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見情況匯總表序號(hào)意見提出單位/專家采納不采納（說明原因）1建議將標(biāo)準(zhǔn)中引用的規(guī)范性文件去除年號(hào)蘭州海關(guān)綜合技術(shù)中心/張宇霞采納2建議在“5.1樣品的選取與制備中”增加“動(dòng)物源性飼料的采樣標(biāo)準(zhǔn)然后用表格表示蘭州海關(guān)綜合技術(shù)中心/張宇霞采納3建議在5實(shí)驗(yàn)方法的適當(dāng)位置加入“樣品檢測時(shí)進(jìn)行平行樣檢測”沈陽海關(guān)技術(shù)中心/耿慶華采納4請斟酌規(guī)范性引用文件是否均需加年號(hào)呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心/趙治國采納5建議“6.1質(zhì)量控制”內(nèi)容簡要描述呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心/趙治國采納6建議在適當(dāng)位置增加“生物安全措