馬駑巴貝斯蟲(chóng)病檢測(cè)方法PCR法編制說(shuō)明

1馬駑巴貝斯蟲(chóng)病檢測(cè)PCR法編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況根據(jù)內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局《內(nèi)蒙古市場(chǎng)監(jiān)督管理局下達(dá)的2020年第2批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃匯總表》，編號(hào)為25，題目為“馬駑巴貝斯蟲(chóng)病檢測(cè)方法PCR法”的計(jì)劃任務(wù)，二連海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組，組織實(shí)施該標(biāo)準(zhǔn)的制定。起草單位：二連海關(guān)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理評(píng)審查驗(yàn)中心。主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、包勇敢、荊文魁、常鴻，騰克。二、項(xiàng)目的意義和必要性馬駑巴貝斯蟲(chóng)病屬于馬梨形蟲(chóng)病的一種，是寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲(chóng)引起。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告檢疫疫病，在我國(guó)被列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。該病在歐洲南部地區(qū)、中東地區(qū)、非洲、亞洲、南美洲均有發(fā)生，廣泛存在于世界各地；在我國(guó)，吉林、新疆、甘肅、河北、廣東、貴州等省份均有報(bào)道，基本遍布全國(guó)，發(fā)病率從20%-77.6%不等。蜱蟲(chóng)是該病最主要的中間2宿主，也是馬駑巴貝斯蟲(chóng)病的主要傳播者。該病臨床表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁，肌肉振顫，呼吸和脈搏加速等癥狀，慢性病例耐過(guò)后體內(nèi)會(huì)長(zhǎng)期帶蟲(chóng)，急性病例嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生死內(nèi)蒙古地區(qū)幅員遼闊，草原面積大，是我國(guó)最重要的馬養(yǎng)殖畜牧大省之一。但是，該病的發(fā)病率在我區(qū)逐年上升，嚴(yán)重制約了我區(qū)馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病的臨床癥狀與其他疾病相似，一些病例無(wú)顯著臨床癥狀，使得用臨床檢查很難準(zhǔn)確的診斷出病因。該病的主要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段有血涂片鏡檢、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA試驗(yàn)、以及PCR試驗(yàn)等方法，幾種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，血涂片鏡檢適合急性感染期的動(dòng)物，對(duì)于蟲(chóng)體感染數(shù)量少或慢性感染的動(dòng)物檢出率都不高；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)主要檢測(cè)動(dòng)物血清中抗體，且感染初期，抗體水平較低時(shí)容易漏檢；但是，PCR檢測(cè)因其直接檢測(cè)病原核酸而非抗體這一特性，能有效的解決上述問(wèn)題的不足。目前，PCR技術(shù)在疫病檢測(cè)當(dāng)中相當(dāng)普及，PCR檢測(cè)因其特異性較強(qiáng)、靈敏度高、大通量等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病中病原的直接檢測(cè)。經(jīng)查閱相關(guān)資料得知，關(guān)于馬努巴貝斯蟲(chóng)病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅有一個(gè)出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)中涉及血液涂片鏡檢，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)等常規(guī)檢3測(cè)手段，但是并未提到PCR檢測(cè)方法，這是該標(biāo)準(zhǔn)唯一不足的地方。因此，有必要結(jié)合以上方法的優(yōu)缺點(diǎn)，建立一種針對(duì)馬駑巴貝斯蟲(chóng)病的PCR檢測(cè)方法作為內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，也是對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要補(bǔ)充。三、標(biāo)準(zhǔn)的起草過(guò)程3.1前期工作項(xiàng)目申請(qǐng)人以及參加人員擁有豐富的科研經(jīng)歷，在動(dòng)物疫病以及動(dòng)物源性成分研究領(lǐng)域具備相應(yīng)的學(xué)科專(zhuān)業(yè)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)操作技能，能夠順利實(shí)施和完成本項(xiàng)目。項(xiàng)目主持人在動(dòng)物源性成分檢測(cè)方面開(kāi)展了大量的工作，積累了較多的經(jīng)驗(yàn)，應(yīng)用普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開(kāi)展檢測(cè)鑒定及定量方法；并在動(dòng)物基因多態(tài)性方面取得重大突破，有著應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)動(dòng)物疫病的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。項(xiàng)目承擔(dān)單位動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室是區(qū)域性中心實(shí)驗(yàn)室，負(fù)責(zé)本地區(qū)及二連口岸檢疫性動(dòng)物疫病檢驗(yàn)檢疫?，F(xiàn)有儀器設(shè)備共計(jì)100多臺(tái)套，價(jià)值1000多萬(wàn)元人民幣。目前，實(shí)驗(yàn)室所購(gòu)置的儀器設(shè)備按照自動(dòng)化、高效化、標(biāo)準(zhǔn)化、高精度化等方向的要求配置，力爭(zhēng)達(dá)到國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平。儀器設(shè)備包括BioRad凝膠成像系統(tǒng)、DNA凝膠電泳系統(tǒng)、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、低溫培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)、生物安全柜、酶標(biāo)儀、液氮罐、基因擴(kuò)增儀、7500熒光定量PCR4儀、全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)、全自動(dòng)基因測(cè)序儀等。目前已經(jīng)構(gòu)建了畜禽疫病分子生物學(xué)快速檢測(cè)平臺(tái)、動(dòng)物源性成分檢測(cè)平臺(tái)。具備開(kāi)展本項(xiàng)目的硬件設(shè)施條件。承擔(dān)單位組織保障措施：承擔(dān)單位二連海關(guān)發(fā)揮組織作用，通過(guò)有效的協(xié)調(diào)和管理，調(diào)動(dòng)本單位和參加單位的有效資源，形成對(duì)項(xiàng)目強(qiáng)有力的支持。通過(guò)組織優(yōu)秀的研究隊(duì)伍，并通過(guò)中期總結(jié)會(huì)、專(zhuān)家研討會(huì)等形式督促項(xiàng)目研究工作的順利完成。3.2制訂起草計(jì)劃編寫(xiě)了內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目建議書(shū)，申請(qǐng)制標(biāo)計(jì)劃。項(xiàng)目獲批后，制定工作思路和技術(shù)路線。同時(shí)制定了標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)劃和安排。3.2.1根據(jù)試驗(yàn)研究，起草“馬駑巴貝斯蟲(chóng)病檢測(cè)PCR3.2.3.形成終稿，2021年5月-2021年8月；四、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)則編寫(xiě)。還參照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)指南的要求。5五、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的研究5.1標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性5.1.1馬駑巴貝斯蟲(chóng)目的基因序列的比對(duì)選擇馬駑巴貝斯蟲(chóng)Bc48基因，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，選擇高度保守的片段做為目的片段。5.1.2標(biāo)準(zhǔn)方法的特異性試驗(yàn)以同種方法提取等量的馬巴貝斯蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)和健康馬血DNA為模版，進(jìn)行PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，檢測(cè)其特5.1.3標(biāo)準(zhǔn)方法的靈敏性試驗(yàn)馬駑巴貝斯蟲(chóng)DNA做10倍的系列稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，取6個(gè)梯度的NDA濃度，針對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR，以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)對(duì)數(shù)與Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.1.4標(biāo)準(zhǔn)方法的重復(fù)性試驗(yàn)?zāi)０暹M(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每次試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，共進(jìn)行3次試驗(yàn)，計(jì)算批內(nèi)和批間Ct值得變異系數(shù)。5.2標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)用性：適用于馬屬動(dòng)物寄生蟲(chóng)病馬駑巴貝斯蟲(chóng)的檢測(cè)，分別采用PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-TimePCR）方法。5.3標(biāo)準(zhǔn)的可行性：該方法在人、機(jī)、料、法、環(huán)等各方面因素具備的條件6下均易實(shí)現(xiàn)。具體說(shuō)就是具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的技術(shù)人員的配備、熒光PCR儀、實(shí)驗(yàn)材料是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料、方法是特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好的PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法、和具有分子生物學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境均可滿(mǎn)足實(shí)施該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測(cè)條件。5.4標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的確定采用已知含馬駑巴貝斯蟲(chóng)的血液樣品，或經(jīng)測(cè)序的陽(yáng)性質(zhì)粒。六.方法驗(yàn)證為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，選擇3家相關(guān)科研或檢測(cè)機(jī)構(gòu)，對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容為方法的特異性和敏感性。3家驗(yàn)證單位進(jìn)行的PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR法驗(yàn)證結(jié)果均符合相關(guān)樣品實(shí)際情況。七.重大意見(jiàn)分歧的處理依據(jù)和結(jié)果無(wú)八.國(guó)內(nèi)外情況簡(jiǎn)要說(shuō)明經(jīng)查閱相關(guān)資料得知，關(guān)于馬努巴貝斯蟲(chóng)病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅有一個(gè)出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)中涉及血液涂片鏡檢，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)等常規(guī)檢測(cè)手段，但是并未提到PCR檢測(cè)方法，這是該標(biāo)準(zhǔn)唯一不足的地方。因此，有必要結(jié)合以上方法的優(yōu)缺點(diǎn)，建立一種針對(duì)馬駑巴貝斯蟲(chóng)病的PCR檢測(cè)方法作為內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，也是對(duì)現(xiàn)7有標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要補(bǔ)充。九.結(jié)論綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過(guò)程中所涉及到的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過(guò)方法學(xué)的驗(yàn)證，并切實(shí)可行，完全達(dá)到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。十.標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見(jiàn)情況匯總表序號(hào)提出單位/專(zhuān)家采納不采納（說(shuō)明原因）1建議對(duì)7.2.1樣品的總DNA提取中蟲(chóng)體的準(zhǔn)備進(jìn)行描述。沈陽(yáng)海關(guān)技術(shù)中心/耿慶華采納21.所有規(guī)范性引用文件應(yīng)在文件中有所提及。3.建議對(duì)照GB/T1.1-2020中相關(guān)要求修改全文格式。4.建議在文中適當(dāng)位置增加“生物安全措施或要求”呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心/趙治國(guó)采納3針”名稱(chēng)分別與7.1.2、7.