馬駑巴貝斯蟲病檢測方法PCR法編制說明

1馬駑巴貝斯蟲病檢測PCR法編制說明一、工作簡況根據(jù)內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局《內(nèi)蒙古市場監(jiān)督管理局下達(dá)的2020年第2批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃匯總表》，編號為25，題目為“馬駑巴貝斯蟲病檢測方法PCR法”的計劃任務(wù)，二連海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)知識的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組，組織實施該標(biāo)準(zhǔn)的制定。起草單位：二連海關(guān)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理評審查驗中心。主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、包勇敢、荊文魁、常鴻，騰克。二、項目的意義和必要性馬駑巴貝斯蟲病屬于馬梨形蟲病的一種，是寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動物紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲引起。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告檢疫疫病，在我國被列為二類動物疫病。該病在歐洲南部地區(qū)、中東地區(qū)、非洲、亞洲、南美洲均有發(fā)生，廣泛存在于世界各地；在我國，吉林、新疆、甘肅、河北、廣東、貴州等省份均有報道，基本遍布全國，發(fā)病率從20%-77.6%不等。蜱蟲是該病最主要的中間2宿主，也是馬駑巴貝斯蟲病的主要傳播者。該病臨床表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁，肌肉振顫，呼吸和脈搏加速等癥狀，慢性病例耐過后體內(nèi)會長期帶蟲，急性病例嚴(yán)重時會發(fā)生死內(nèi)蒙古地區(qū)幅員遼闊，草原面積大，是我國最重要的馬養(yǎng)殖畜牧大省之一。但是，該病的發(fā)病率在我區(qū)逐年上升，嚴(yán)重制約了我區(qū)馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病的臨床癥狀與其他疾病相似，一些病例無顯著臨床癥狀，使得用臨床檢查很難準(zhǔn)確的診斷出病因。該病的主要實驗室檢測手段有血涂片鏡檢、補(bǔ)體結(jié)合試驗、ELISA試驗、以及PCR試驗等方法，幾種方法各有其優(yōu)缺點，血涂片鏡檢適合急性感染期的動物，對于蟲體感染數(shù)量少或慢性感染的動物檢出率都不高；補(bǔ)體結(jié)合試驗和ELISA試驗主要檢測動物血清中抗體，且感染初期，抗體水平較低時容易漏檢；但是，PCR檢測因其直接檢測病原核酸而非抗體這一特性，能有效的解決上述問題的不足。目前，PCR技術(shù)在疫病檢測當(dāng)中相當(dāng)普及，PCR檢測因其特異性較強(qiáng)、靈敏度高、大通量等特點，廣泛應(yīng)用于動物疫病中病原的直接檢測。經(jīng)查閱相關(guān)資料得知，關(guān)于馬努巴貝斯蟲病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅有一個出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)中涉及血液涂片鏡檢，補(bǔ)體結(jié)合試驗和ELISA試驗等常規(guī)檢3測手段，但是并未提到PCR檢測方法，這是該標(biāo)準(zhǔn)唯一不足的地方。因此，有必要結(jié)合以上方法的優(yōu)缺點，建立一種針對馬駑巴貝斯蟲病的PCR檢測方法作為內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)，同時，也是對現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的一個重要補(bǔ)充。三、標(biāo)準(zhǔn)的起草過程3.1前期工作項目申請人以及參加人員擁有豐富的科研經(jīng)歷，在動物疫病以及動物源性成分研究領(lǐng)域具備相應(yīng)的學(xué)科專業(yè)知識和實驗操作技能，能夠順利實施和完成本項目。項目主持人在動物源性成分檢測方面開展了大量的工作，積累了較多的經(jīng)驗，應(yīng)用普通PCR技術(shù)、實時熒光PCR技術(shù)開展檢測鑒定及定量方法；并在動物基因多態(tài)性方面取得重大突破，有著應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測動物疫病的技術(shù)優(yōu)勢。項目承擔(dān)單位動物檢疫實驗室是區(qū)域性中心實驗室，負(fù)責(zé)本地區(qū)及二連口岸檢疫性動物疫病檢驗檢疫。現(xiàn)有儀器設(shè)備共計100多臺套，價值1000多萬元人民幣。目前，實驗室所購置的儀器設(shè)備按照自動化、高效化、標(biāo)準(zhǔn)化、高精度化等方向的要求配置，力爭達(dá)到國內(nèi)先進(jìn)水平。儀器設(shè)備包括BioRad凝膠成像系統(tǒng)、DNA凝膠電泳系統(tǒng)、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、低溫培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)、生物安全柜、酶標(biāo)儀、液氮罐、基因擴(kuò)增儀、7500熒光定量PCR4儀、全自動核酸提取系統(tǒng)、全自動基因測序儀等。目前已經(jīng)構(gòu)建了畜禽疫病分子生物學(xué)快速檢測平臺、動物源性成分檢測平臺。具備開展本項目的硬件設(shè)施條件。承擔(dān)單位組織保障措施：承擔(dān)單位二連海關(guān)發(fā)揮組織作用，通過有效的協(xié)調(diào)和管理，調(diào)動本單位和參加單位的有效資源，形成對項目強(qiáng)有力的支持。通過組織優(yōu)秀的研究隊伍，并通過中期總結(jié)會、專家研討會等形式督促項目研究工作的順利完成。3.2制訂起草計劃編寫了內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)項目建議書，申請制標(biāo)計劃。項目獲批后，制定工作思路和技術(shù)路線。同時制定了標(biāo)準(zhǔn)的計劃和安排。3.2.1根據(jù)試驗研究，起草“馬駑巴貝斯蟲病檢測PCR3.2.3.形成終稿，2021年5月-2021年8月；四、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)則編寫。還參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)編寫指南的要求。5五、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的研究5.1標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性5.1.1馬駑巴貝斯蟲目的基因序列的比對選擇馬駑巴貝斯蟲Bc48基因，經(jīng)過序列比對，選擇高度保守的片段做為目的片段。5.1.2標(biāo)準(zhǔn)方法的特異性試驗以同種方法提取等量的馬巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲和健康馬血DNA為模版，進(jìn)行PCR及實時熒光PCR檢測，檢測其特5.1.3標(biāo)準(zhǔn)方法的靈敏性試驗馬駑巴貝斯蟲DNA做10倍的系列稀釋，分別進(jìn)行PCR及實時熒光PCR試驗，取6個梯度的NDA濃度，針對實時熒光PCR，以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)對數(shù)與Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.1.4標(biāo)準(zhǔn)方法的重復(fù)性試驗?zāi)０暹M(jìn)行重復(fù)性試驗，每次試驗設(shè)3次重復(fù)，共進(jìn)行3次試驗，計算批內(nèi)和批間Ct值得變異系數(shù)。5.2標(biāo)準(zhǔn)的實用性：適用于馬屬動物寄生蟲病馬駑巴貝斯蟲的檢測，分別采用PCR和實時熒光PCR（Real-TimePCR）方法。5.3標(biāo)準(zhǔn)的可行性：該方法在人、機(jī)、料、法、環(huán)等各方面因素具備的條件6下均易實現(xiàn)。具體說就是具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的技術(shù)人員的配備、熒光PCR儀、實驗材料是分子生物學(xué)實驗材料、方法是特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好的PCR和實時熒光PCR方法、和具有分子生物學(xué)檢測的實驗室環(huán)境均可滿足實施該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測條件。5.4標(biāo)準(zhǔn)陽性對照的確定采用已知含馬駑巴貝斯蟲的血液樣品，或經(jīng)測序的陽性質(zhì)粒。六.方法驗證為驗證本方法的有效性和適用性，選擇3家相關(guān)科研或檢測機(jī)構(gòu)，對本方法進(jìn)行驗證，驗證內(nèi)容為方法的特異性和敏感性。3家驗證單位進(jìn)行的PCR及實時熒光PCR法驗證結(jié)果均符合相關(guān)樣品實際情況。七.重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果無八.國內(nèi)外情況簡要說明經(jīng)查閱相關(guān)資料得知，關(guān)于馬努巴貝斯蟲病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)僅有一個出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)中涉及血液涂片鏡檢，補(bǔ)體結(jié)合試驗和ELISA試驗等常規(guī)檢測手段，但是并未提到PCR檢測方法，這是該標(biāo)準(zhǔn)唯一不足的地方。因此，有必要結(jié)合以上方法的優(yōu)缺點，建立一種針對馬駑巴貝斯蟲病的PCR檢測方法作為內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)，同時，也是對現(xiàn)7有標(biāo)準(zhǔn)的一個重要補(bǔ)充。九.結(jié)論綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過程中所涉及到的各項技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過方法學(xué)的驗證，并切實可行，完全達(dá)到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。十.標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見情況匯總表序號提出單位/專家采納不采納（說明原因）1建議對7.2.1樣品的總DNA提取中蟲體的準(zhǔn)備進(jìn)行描述。沈陽海關(guān)技術(shù)中心/耿慶華采納21.所有規(guī)范性引用文件應(yīng)在文件中有所提及。3.建議對照GB/T1.1-2020中相關(guān)要求修改全文格式。4.建議在文中適當(dāng)位置增加“生物安全措施或要求”呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心/趙治國采納3針”名稱分別與7.1.2、7.