AbMole探索T細胞急性淋巴細胞疾?。簃6A 修飾對 IRF8 的調(diào)控及作用機制

AbMole|探索T細胞急性淋巴細胞疾?。簃6A修飾對IRF8的調(diào)控及作用機制T細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL）是一種嚴重威脅人類健康的血液惡性腫瘤，其發(fā)病機制復雜。近年來，N6-甲基腺苷（m6A）修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。來自山東大學齊魯醫(yī)院血液科清魯醫(yī)學院的YingZhou,MinJi,YuanXia等多名研究人員發(fā)表了題為《SilencingofIRF8Mediatedbym6AModificationPromotestheProgressionofT-CellAcuteLymphoblasticLeukemia》的研究成果。在該文章中，研究人員引用了AbMole的FB23-2（目錄號M9422）、ActinomycinD（目錄號M4881）。AbMole（奧默生物）提供高品質(zhì)抑制劑、細胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫。本研究旨在探討m6A修飾與T-ALL之間的關(guān)系，特別是其對干擾素調(diào)節(jié)因子8（IRF8）表達的影響以及對T-ALL細胞生物學行為的作用。文章中主要分析了以下幾點：（一）IRF8在T-ALL患者中表達顯著降低通過對多個數(shù)據(jù)集的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)IRF8在T-ALL患者中的表達明顯低于健康供體和B-ALL患者。在基因表達分析中，從多中心研究的3個數(shù)據(jù)集中確定了43個差異表達基因（DEGs），IRF8是其中顯著下調(diào)的基因之一。在臨床樣本中，新診斷的T-ALL患者隊列的mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測也證實了IRF8的低表達，并且低水平的IRF8與不良的臨床指標相關(guān)，如較短的無復發(fā)生存期、較高的白細胞計數(shù)、較低的血小板計數(shù)和較高的骨髓原始細胞比例。（二）IRF8抑制T-ALL細胞的增殖和侵襲細胞增殖實驗在T-ALL細胞系Molt4和Jurkat中過表達IRF8后，細胞增殖能力受到顯著抑制。CCK8實驗顯示細胞生長速度明顯減慢，EdU實驗表明DNA復制率降低，細胞周期分析發(fā)現(xiàn)G0/G1期細胞周期阻滯，G2/M期和S期細胞比例減少，同時細胞的集落形成能力也顯著下降。細胞侵襲和遷移實驗過表達IRF8還抑制了T-ALL細胞的侵襲和遷移能力。侵襲實驗中，IRF8過表達組細胞穿透Matrigel-coatedmembrane的數(shù)量減少，遷移實驗也顯示細胞的遷移能力受損。圖1抑制的IRF8表達是T-ALL增殖和侵襲的原因。（三）Irf8敲除促進體內(nèi)Notch1誘導的T-ALL進展研究人員構(gòu)建了動物模型，將從Irf8+/+或Irf8-/-小鼠中分離的骨髓Lin-細胞感染表達NOTCH1胞內(nèi)域和綠色熒光蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后移植到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Irf8-/-組小鼠表現(xiàn)出更嚴重的T-ALL進展，包括肝脾腫大、股骨蒼白、多器官白細胞增多、紅細胞減少和浸潤。流式細胞術(shù)（FACS）分析和組織學染色顯示，骨髓和血液中白血病淋巴母細胞頻率更高，Ki67水平增加，表明細胞增殖加快，并且中位生存時間縮短。圖2Irf8的敲除加速了Notch1誘導的T-ALL的進展。（四）IRF8通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控PIK3R5抑制PI3K/AKT通路的激活RNA-seq分析表明，IRF8過表達的Molt4細胞中PI3K/AKT信號通路顯著富集。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IRF8過表達導致PIK3R5下調(diào)，同時磷酸化AKT（p-AKT）和下游磷酸化的雷帕霉素靶蛋白激酶（p-MTOR）水平降低，以及CCR2蛋白水平也降低。在T-ALL小鼠模型中，Irf8-/-組的T-ALL細胞顯示PIK3R5表達增加，與AKT磷酸化增強一致。體內(nèi)外的救援實驗證實了PIK3R5對IRF8在T-ALL中抑制作用的重要性。圖3IRF8通過抑制PIK3R5轉(zhuǎn)錄來抑制PI3K/AKT通路激活。（五）IRF8在T-ALL中被m6A相關(guān)的eraserFTO沉默基因集富集分析對T-ALL數(shù)據(jù)集進行基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)多個與RNA生物學過程相關(guān)的基因集在T-ALL患者中顯著富集。同時，m6A調(diào)節(jié)劑FTO在T-ALL患者中的表達顯著高于健康供體。FTO與IRF8的關(guān)系Pearson相關(guān)性分析顯示，在兩個獨立的T-ALL隊列中，F(xiàn)TO和IRF8表達呈顯著負相關(guān)。通過小發(fā)夾RNA（shRNA）敲低FTO或使用FTO抑制劑FB23-2處理Molt4細胞，均可導致IRF8表達水平增加，同時細胞增殖受到抑制。（六）FTO通過m6A依賴機制負調(diào)控IRF8RNA-seq、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）-seq以及FTORIP-seq分析表明，F(xiàn)TO抑制劑FB23-2處理后，IRF83′非翻譯區(qū)（UTR）的m6A水平顯著增加，F(xiàn)TO結(jié)合峰在IRF8mRNA轉(zhuǎn)錄本中富集。通過設計引物擴增IRF83′UTR中潛在的結(jié)合位點，確定了五個潛在的m6A位點。構(gòu)建野生型和突變型IRF83′UTR報告載體轉(zhuǎn)染細胞實驗證實，F(xiàn)TO通過這些m6A位點負調(diào)控IRF8mRNA表達。圖4FTO通過m6A劑量依賴性機制抑制IRF8。（七）FTO通過影響RNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)IRF8表達RNA穩(wěn)定性實驗顯示，F(xiàn)TO抑制劑FB23-2處理Molt4和Jurkat細胞后，IRF8轉(zhuǎn)錄本的半衰期顯著增加。在HEK293T細胞中過表達野生型或突變型IRF83′UTR的實驗表明，m6A位點的突變顯著縮短了IRF8mRNA轉(zhuǎn)錄本的半衰期，同時MeRIP-qPCR分析證實突變降低了IRF83′UTR上的m6A水平。（八）FTO抑制劑恢復IRF8表達，抑制PI3K/AKT通路，并在體內(nèi)顯示抗白血病作用在T-ALL小鼠模型中使用FTO抑制劑FB23-2治療，在Irf8+/+組中，顯著降低了骨髓、血液和脾臟中GFP+細胞的比例，緩解了脾腫大，抑制了細胞增殖，延長了小鼠的生存時間。同時，免疫印跡和免疫熒光分析顯示，F(xiàn)B23-2顯著增加了骨髓和脾臟白血病細胞的IRF8表達，抑制了PIK3R5的表達和AKT的磷酸化；而在Irf8-/-組未觀察到明顯差異。綜上所述，本研究通過一系列實驗揭示了m6A修飾在T-ALL中的重要作用。FTO作為m6A修飾的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過負調(diào)控IRF8的表達促進T-ALL的進展。IRF8可抑制T-ALL細胞的增殖、侵襲，并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控PIK3R5抑制PI3K/AKT通路的激活。FTO抑制劑能夠恢復IRF8的表達，抑制