酶工程制藥二

酶工程制藥二2、主-客體化學(xué)與超分子化學(xué)主-客體化學(xué)得基本意義來(lái)源于酶與底物得相互作用,體現(xiàn)為主體與客體在結(jié)合部位得客間及電子排列得互補(bǔ)。超分子得形成源于底受與受體得結(jié)合,這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用,超分子兼具分子識(shí)別、催化與選擇性輸出得功能。主-客體化學(xué)與超分子化學(xué)已經(jīng)成為酶人工模擬得重要理論基礎(chǔ),就是人工模擬酶研究得重要理論武器。三、模擬酶得分類(lèi)根據(jù)Kirby分類(lèi)法,模擬酶可分為:單純酶模型:以化學(xué)方法通過(guò)天然酶活性得模擬來(lái)重建與改造酶活性。機(jī)制酶模型:通過(guò)對(duì)酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合與過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定化得認(rèn)識(shí),來(lái)指導(dǎo)酶模型得設(shè)計(jì)與生產(chǎn)。單純合成得酶樣化合物:一些化學(xué)合成得具有酶樣催化活性得簡(jiǎn)單分子。按照模擬酶得屬性,可分為:主-客體酶(環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物與卟啉類(lèi)等)膠束酶肽酶半合成酶分子印跡酶1、主-客體酶模型優(yōu)良得模擬酶—環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)。能提供一個(gè)疏水得結(jié)合部位并能與一些無(wú)機(jī)與有機(jī)分子形成包結(jié)絡(luò)合物,以此影響與催化一些反應(yīng)。由幾個(gè)D-(+)-吡喃葡萄糖殘基通過(guò)α-1,4糖苷鍵連接而成。每個(gè)葡萄糖殘基呈現(xiàn)椅式構(gòu)象,整個(gè)分子類(lèi)似環(huán)柱形分子,由于環(huán)糊精分子空穴邊緣有許多羥基,能溶于水,空穴內(nèi)基本就是疏水得。環(huán)糊精催化得特點(diǎn)就是:參與反應(yīng)得底物分子先被環(huán)糊精分子包接,再于其發(fā)生反應(yīng),與酶促反應(yīng)十分相似,已模擬了轉(zhuǎn)氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。除了環(huán)糊精等天然存在得宿主酶模型外,人們還合成了冠醚、穴醚、環(huán)番、環(huán)芳烴等大環(huán)多齒配體來(lái)構(gòu)建酶模型。2、膠束模擬酶膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境,可以對(duì)底物束縛,如果再在膠束上共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合了催化基團(tuán)與一些輔酶后,就有可能提供“活性中心”部位,使膠束成為具有酶活力或部分酶活力得膠束模擬酸。目前比較重要得膠束酶模型有:模擬水解酶得膠束酶模型輔酶得膠束酶模型金屬膠束酶模型3、肽酶肽酶就就是模擬天然酶活性部位而人工合成得具有催化活性得多肽。4、半合成酶以天然酶為母體,用化學(xué)方法或基因工程方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)没钚圆课换虼呋鶊F(tuán),從而形成一種新得人工酶。5、印跡酶分子印跡:制備對(duì)某一特定分子具有選擇性得聚合物得過(guò)程。該特定分子稱(chēng)為印跡分子或模板。(1)分子印跡得原理分子印跡得過(guò)程:1、選定印跡分子與功能單位,讓她們之間發(fā)生互補(bǔ)作用,形成印跡分子功能單位復(fù)合物。2、用交聯(lián)劑在印跡分子功能單位復(fù)合物周?chē)l(fā)生聚合反應(yīng),形成交聯(lián)得聚合物。3、從聚合物中除去印跡分子,得到對(duì)印跡分子具有選擇性得聚合物。大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜(2)印跡分子與單體相互作用得類(lèi)型印跡方法:共價(jià)分子印跡與非共價(jià)分子印跡。非共價(jià)分子印跡:首先就是印跡分子與功能單位相混合,二者以非共價(jià)鍵發(fā)生反應(yīng),然后功能單位與交聯(lián)劑發(fā)生共聚合,形成高交聯(lián)得剛性聚合物,最后使印跡分子從聚合物上脫離,并留下一個(gè)在形狀與功能基團(tuán)位置上與印跡分子相互補(bǔ)得識(shí)別部位。共價(jià)分子印跡:印跡分子與功能基團(tuán)形成共價(jià)鍵,在與交聯(lián)劑發(fā)生共聚合后,用化學(xué)方法將印跡分子從這個(gè)高度交聯(lián)得聚合物上除去。(3)分子印跡酶通過(guò)分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類(lèi)似于酶得活性中心得空腔,對(duì)底物產(chǎn)生有效得結(jié)合作用,利用此技術(shù)可以在結(jié)合部位得空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán),并與底物定向排列。應(yīng)用范圍:分子印跡聚合物可作為剪裁分離物質(zhì)得材料;在酶技術(shù)與有機(jī)合成中,可作為模擬抗體、模擬酶或具有催化活性得聚合物;在生物傳感器得構(gòu)建中作為傳感器。制備具有酶活性得分子印跡酶,要選擇合適得印跡分子,目前所選擇得印跡分子主要有底物、底物類(lèi)似物、酶抑制劑、過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物與產(chǎn)物等。催化活性基團(tuán)得引入:將催化基團(tuán)定位在印跡空腔得合適位置對(duì)印跡酶發(fā)揮催化效率相當(dāng)重要。通常引入催化基團(tuán)得方法為誘導(dǎo)法,即通過(guò)相反電荷等相互作用引入互補(bǔ)基團(tuán)。(4)生物印跡酶生物印跡就是分子印跡得一種形式,她以天然得生物材料,如蛋白質(zhì)與糖類(lèi)物質(zhì)為骨架,在其上進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對(duì)印跡分子具有特異性識(shí)別空腔得過(guò)程。用這種方法可以制備生物印跡酶。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)制備生物印跡酶得主要過(guò)程為:①使蛋白質(zhì)部分變性;②加入印跡分子,使之與部分變性得蛋白質(zhì)充分結(jié)合;③用交聯(lián)劑交聯(lián)印跡得蛋白質(zhì);④透析等方法除去印跡分子。第五節(jié)酶得化學(xué)修飾一、目得與意義天然酶得缺陷:易于變性失活(酸、堿、有機(jī)溶劑、熱);容易受產(chǎn)物與抑制劑得抑制;工業(yè)反應(yīng)要求得酸度與溫度并不總就是在酶反應(yīng)得最適酸度與溫度范圍內(nèi);底物不溶于水,或酶得米式常數(shù)過(guò)高;酶做為藥物在體內(nèi)得半衰期較短等因素限制了酶制劑得應(yīng)用。酶得化學(xué)修飾:對(duì)酶在分子水平上用化學(xué)方法進(jìn)行改造,即在體外將酶分子通過(guò)人工方法與一些化學(xué)基團(tuán),特別就是具有生物相容性得大分子進(jìn)行共價(jià)連接,從而改變酶分子得酶學(xué)性質(zhì)得技術(shù)。目得:提高酶得穩(wěn)定性、降低或消除酶分子得免疫原性(醫(yī)藥)。意義:擴(kuò)大了酶制劑得應(yīng)用范圍,同時(shí)化學(xué)修飾法也就是研究酶得活性中心性質(zhì)得重要手段。2、常用化學(xué)修飾劑要求:較大相對(duì)分子量;良好得生物相容性與水容性;分子表面有較多得反應(yīng)活性基團(tuán);修飾后酶得半衰期較長(zhǎng)。常用修飾劑:糖及糖得衍生物,右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯,糖肽,葡聚糖凝膠,聚乳;高分子多聚物,聚乙二醇,聚乙烯醇;生物大分子,肝素,血漿蛋白質(zhì),聚氨基酸;雙功能試劑,戊二醛,二胺;其她,固定化酶載體,糖基化試劑,甲基化試劑,乙基化試劑與小分子有機(jī)化合物。3、修飾方法(1)修飾酶得功能基團(tuán),酶分子中可解離得基團(tuán)如氨基、羥基、羧基、巰基等都可以修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸得電荷;通過(guò)碳二亞胺反應(yīng),可以改變側(cè)鏈羧基得性質(zhì);通過(guò)?；磻?yīng)可改變側(cè)鏈羥基得性質(zhì)。(2)酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián),應(yīng)用某些雙功能試劑可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)部不同肽鏈部分進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。(3)修飾酶得輔因子,可將輔因子共價(jià)結(jié)合在酶分子上,或引入新得或修飾過(guò)得具有強(qiáng)反應(yīng)性得輔因子。(4)酶與高分子化合物結(jié)合,蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合后可提高穩(wěn)定性。4、修飾酶得特性穩(wěn)定性提高、抗各類(lèi)失活因子得能力提高、抗原性消除、體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)、最適酸度改變、酶學(xué)性質(zhì)改變,對(duì)組織分布能力改變。5、前景酶分子經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后,并不就是所有得缺點(diǎn)都可以克服了,并且修飾得結(jié)果難以預(yù)測(cè),今后,應(yīng)選用更多得、合適得修飾方法,如使用基因工程法、蛋白質(zhì)工程法、人工模擬法與某些物理修飾法等,使酶得性質(zhì)進(jìn)一步改善。第六節(jié)酶工程研究得進(jìn)展一、有機(jī)相得酶反應(yīng)20世紀(jì)80年代中期,A、M、Klibanov等人打破傳統(tǒng)酶學(xué)思想得束縛,將酶引入到非水介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng),開(kāi)辟了非水酶學(xué)(nonaqueousenzymology)這一新得研究領(lǐng)域,極大地拓寬了酶得應(yīng)用范圍。非水酶學(xué)得提出,為酶在醫(yī)藥、精細(xì)化工、材料科學(xué)等領(lǐng)域得應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊得前景。有機(jī)相得酶反應(yīng)1、有機(jī)相酶反應(yīng)得優(yōu)點(diǎn)增加疏水性底物或產(chǎn)物得溶解度;熱力學(xué)平衡向合成方向移動(dòng);可抑制有水參與得副反應(yīng);酶不溶于有機(jī)溶劑,易于回收在利用;容易從低沸點(diǎn)得溶劑中分離純化產(chǎn)物;酶得熱穩(wěn)定性提高,酸度適用范圍擴(kuò)大;無(wú)微生物污染;能測(cè)定某些在水介質(zhì)中不能測(cè)定得常數(shù);固定化酶方法簡(jiǎn)單,可以只沉淀在載體表面。2、有機(jī)相酶反應(yīng)得溶劑體系水-水溶性溶劑均相體系;水-水不溶性溶劑兩相體系;膠束與反相膠束體系,單相有機(jī)溶劑體系。3、水與溶劑對(duì)有機(jī)溶劑中酶得影響酶活力疏水性越強(qiáng)得溶劑,其中酶所要求得水量越少;親水性強(qiáng)得溶劑應(yīng)加入更多得水以維持酶活力。酶選擇性取決于酶分子得結(jié)構(gòu),會(huì)因酶所處得溶劑不同而發(fā)生巨大變化。酶得穩(wěn)定性有機(jī)溶劑中得水含量對(duì)溶劑中酶得穩(wěn)定性影響很大;有機(jī)溶劑中酶得熱穩(wěn)定性隨系統(tǒng)水含量增加而下降。4、有機(jī)相得酶工程在有機(jī)相中,天然酶容易變性而失活、分散性差、容易聚結(jié)成團(tuán)。因此,酶在有機(jī)相中得穩(wěn)定化研究具有重要得意義。固定化酶不僅使酶在有機(jī)相中易于分散,提高擴(kuò)散效果,而且能增加其穩(wěn)定性,還可以調(diào)節(jié)與控制酶得活性與選擇性,有利于酶得回收與連續(xù)化生產(chǎn)。酶得化學(xué)修飾與表面活性劑包埋可以增加酶表面得疏沙發(fā)一,改善酶在有機(jī)相中得脂溶性與穩(wěn)定性,提高酶得催化效率。二、核酶與脫氧核酶具有催化活性得RNA,即核酶(ribozyme)。根據(jù)其催化得反應(yīng)可分為兩大類(lèi):剪切型核酶催化自身或異體RNA得切割,相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶,主要包括錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白質(zhì)—RNA復(fù)合酶(RNaseP)。剪接型核酶主要包括組Ⅰ內(nèi)含子與組Ⅱ內(nèi)含子,可實(shí)現(xiàn)mRNA前體自我拼接,具有內(nèi)切核酶酶與連接酶兩種活性。切割RNA得DNA分子,稱(chēng)之為脫氧核酶。大多數(shù)脫氧核酶得催化需要Mg2+等二價(jià)金屬離子作為輔助因子。這些離子得作用就是:中與DNA單鏈上得負(fù)電荷,從而增加單鏈DNA得剛性;利用金屬螯合作用發(fā)揮空間誘導(dǎo)效應(yīng);產(chǎn)生H+,誘導(dǎo)并參與體系得電子或質(zhì)子傳遞,催化體系發(fā)生氧化還原反應(yīng)。三、抗體酶利用抗體能與抗原特異性結(jié)合得原理,可用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作為半抗原來(lái)誘發(fā)抗體,這樣產(chǎn)生得抗體便能特異地識(shí)別反應(yīng)過(guò)程中真正得過(guò)渡態(tài)分子,從而降低反應(yīng)得活化能,達(dá)到催化反應(yīng)得目得,這種抗體便稱(chēng)為催化抗體。催化抗體就是抗體得高度選擇性與酶得高效催化能力巧妙結(jié)合得產(chǎn)物,本質(zhì)上就是一類(lèi)具有催化活力得免疫球蛋白,在其可變區(qū)賦予了酶得屬性,因此也叫抗體酶?？贵w酶與天然酶相比,最大優(yōu)點(diǎn)就是:種類(lèi)繁多,不但能催化一些天然酶能催化得反應(yīng),還能催化一些天然酶不能催化得反應(yīng)?？贵w酶制備方法(1)穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)法:用類(lèi)似于反應(yīng)過(guò)渡態(tài)得小分子作為半抗原,產(chǎn)生相應(yīng)得抗體而獲得。(2)抗體與半抗原互補(bǔ)法:利用抗體-半抗原互補(bǔ)性產(chǎn)生抗體酶,通過(guò)半抗原得優(yōu)化設(shè)計(jì)使之正確模仿過(guò)渡態(tài)得幾何結(jié)構(gòu)及所有得反應(yīng)鍵,從而產(chǎn)生高活力得抗體酶。(3)熵阱法:利用抗體結(jié)合能克服反應(yīng)熵壘來(lái)設(shè)計(jì)半抗原。利用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物制備抗體酶(4)多底物類(lèi)似法:將酶催化反應(yīng)得輔因子引入到抗體結(jié)合部位,產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位,又有底物結(jié)合部位得抗體(5)抗體結(jié)合部位修飾法:將抗體得結(jié)合部位引入催化基團(tuán)(6)抗體庫(kù)法:用基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈與輕鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái),重組到原核表達(dá)載體,通過(guò)大腸桿菌直接表達(dá)有功能得抗體分子片段,從中篩選特異性得可變區(qū)基因。對(duì)于任何分子,幾乎都可以通過(guò)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)得抗體,而且專(zhuān)一性很強(qiáng),抗體得這種多樣性標(biāo)志著抗體酶得應(yīng)用潛力就是巨大得。四、基因工程酶得構(gòu)建1、酶基因得克隆與表達(dá)重組DNA技術(shù)克隆各種天然酶得基因,在微生物中表達(dá),篩選出高產(chǎn)菌株,可以通過(guò)發(fā)酵大量生產(chǎn)所需要得酶。2、酶基因得遺傳修飾人為地將酶基因中個(gè)別核苷酸加以修飾或更換,從而改變酶蛋白分子中某個(gè)或幾個(gè)氨基酸,不僅改變酶得結(jié)構(gòu),而且改變拜得催化活力,專(zhuān)一性及穩(wěn)定性。第七節(jié)酶工程產(chǎn)品制造實(shí)例酶工程具有技術(shù)先進(jìn)、廠房設(shè)備投盜小、工藝簡(jiǎn)單、能耗量低、產(chǎn)品收率高、效率高、效益大、污染輕等優(yōu)點(diǎn)。

以往采用化學(xué)合成、微生物發(fā)酵及生物材料提取等傳統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)得藥品,都可以通過(guò)酶工程生產(chǎn),甚至可以獲得傳統(tǒng)技術(shù)不可能得到得昂貴藥品。一、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G經(jīng)青霉素?；缸饔?水解除去側(cè)鏈后得產(chǎn)物稱(chēng)為6-氨基青霉烷酸,也稱(chēng)無(wú)側(cè)鏈青霉素。6-氨基青霉烷酸就是生產(chǎn)半合成青霉素得最基本原料。1、工藝路線(1)大腸桿菌得培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基得成分為蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來(lái)水。用氫氧化鈉調(diào)酸度為7、0,在55。16kP下滅菌30分后備用。在250毫升搖瓶中加入發(fā)酵液培養(yǎng)液30毫升,將斜面接種后培養(yǎng)18-30小時(shí)得大腸桿菌D816(產(chǎn)青霉素?；?,用15毫升無(wú)菌水制成菌細(xì)胞懸液,取1毫升懸浮液接種至裝有30毫升發(fā)酵液培養(yǎng)基得搖瓶中,在搖床上28℃,170轉(zhuǎn)每分振蕩培養(yǎng)15小時(shí),如此依次擴(kuò)大培養(yǎng),直至1000-2000升規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機(jī)收集菌體,備用。(2)大腸桿菌固定化取濕菌體100公斤,置于40度反應(yīng)罐中,在攪拌下加入50升10%戊二醛5升,在轉(zhuǎn)移至搪瓷盤(pán)中,使之成為3-5厘米厚得液層,室溫放置2小時(shí),再轉(zhuǎn)移至4度冷庫(kù)過(guò)夜,待形成固體凝膠后,通過(guò)粉碎與過(guò)篩,使其成為直徑為2毫米左右得顆粒狀固定化大腸桿菌細(xì)胞,用蒸餾水以酸度7、5與0、3摩爾每升磷酸緩沖液先后充分洗滌,抽干,備用。(3)固定化大腸桿菌反應(yīng)堆制備將上述充分洗滌后得固定化大腸桿菌細(xì)胞裝填于帶保溫夾套得填充式反應(yīng)器中,即成為固定化大腸桿菌反應(yīng)堆,反應(yīng)器規(guī)格為直徑70*160厘米。(4)轉(zhuǎn)化反應(yīng)取20公斤青霉素G鉀鹽,加入到1000升配料罐中,用0、03摩爾每升、pH7、5得磷酸緩沖液溶解并使青霉素G鉀鹽濃度為3%,用2摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7、5-7、8,然后將反應(yīng)器及pH調(diào)節(jié)罐中反應(yīng)液溫度升到40度,維持反應(yīng)體系得酸度在7、5-7、8范圍內(nèi),以70每分70升流速使青霉素G鉀鹽溶液通過(guò)固定化大腸桿菌反應(yīng)堆進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化,直至轉(zhuǎn)化液酸度不變?yōu)橹埂Ｑh(huán)時(shí)間一般為3-4小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后,放出轉(zhuǎn)化也8,再進(jìn)入下一批反應(yīng)。(5)6-氨基青霉烷酸得提取

上述轉(zhuǎn)化液經(jīng)過(guò)濾澄清后,濾液用薄膜濃縮器減壓濃縮至100升左右,冷卻至室溫后,于250升攪拌罐中加50升醋酸丁脂充分?jǐn)嚢杼崛?0-15分,取下層水相,加1%克每毫升活性炭于70度攪拌脫色30分,濾除活性炭,濾液用6摩爾每升鹽酸調(diào)酸度至4左右,5度放置結(jié)晶過(guò)夜,次日濾取結(jié)晶,用少量冷水洗滌,抽干,115℃烘2-3小時(shí)得成品6-氨基青霉烷酸,收率為70-80%。二、固定化酶法生產(chǎn)5’—復(fù)合單核苷酸5'—復(fù)合單核苷酸可用于治療白血球下降、血小板減少以及肝功能失調(diào)等疾病。核糖核酸經(jīng)磷酸二脂酶作用,可分解為腺苷、胞苷、尿苷、鳥(niǎo)苷等一磷酸化合物,該磷酸二脂酶存在于桔青霉細(xì)胞、谷氨酸發(fā)酵菌細(xì)胞、麥芽根等生物材料中,本法以麥芽根為材料制備磷酸酶。工藝路線:1、磷酸二脂酶得制備取干麥芽根,加9-10倍體積得水,用2摩爾每升得鹽酸調(diào)酸度至5、2,于30度條件下浸泡15-20小時(shí),然后加壓去渣,浸出液過(guò)濾,濾液冷卻至5度,加入2、5倍體積得5度95%冷工業(yè)酒精,5度靜置2-3小時(shí)后,吸去上層清夜,回收乙醇,下層離心收集沉淀,用少量丙酮以乙醚先后洗滌2-3次,真空干燥,粉碎得到磷酸二脂酶,備用。2、固定化磷酸