DB34∕T 4203-2022 豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程

34RegulationfordetectionofextraintestinalpathogenicEscherichiacolifromswineI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程GB4789.6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏GB4789.38食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏GB4789.41食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)c桿菌SN/T2025動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室生SN/T2984檢驗(yàn)檢疫動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)生物3.1腸外致病性大腸桿菌extraintestinalpatho4主要設(shè)備和材料4,1顯微鏡：10×~100×。4,4冰箱：0℃~4℃。4,6無(wú)菌試管：12mm×100mm，15mm×150mm。4.7麥?zhǔn)媳葷峁堋?）：5操作規(guī)程5.2操作步驟5.2.1樣品采集采集：無(wú)菌操作采集病豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、腦等腸外組織，或關(guān)節(jié)積液、心包保存與運(yùn)輸：病料樣品采集后不能及時(shí)鹽水溶液中，保存時(shí)間不超過(guò)72h。樣品均需采取低溫（0℃~4℃)保存和運(yùn)輸。5.2.2細(xì)菌分離與純化落呈鮮桃紅色或粉紅色，中等大小，直徑1.0mm～2.5mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑）再5.2.3腸外大腸桿菌鑒定形態(tài)特征鑒定：革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為革蘭氏陰性直短桿菌，兩端鈍圓，無(wú)芽孢，多生化特性鑒定：先取純化菌落接種三糖鐵（TSI）瓊脂斜面糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h～24h，進(jìn)行吲5.2.4腸外大腸桿菌致病性鑒定并將死亡的小鼠在無(wú)菌操作下取其肺臟、肝臟、脾臟組織分別接種于MAC，37℃培養(yǎng)24h，挑取大腸35.2.6腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群鑒定4A.1飽和氯化鈉溶液A.1.1成分A.1.2制法將38.0g～39.0g氯化鈉加入100mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢瑁耆芙饣靹蚝?，分裝于采樣A.230％甘油緩沖鹽水溶液A.2.1成分A.2.2制法A.3.1成分A.3.2制法5↓（菌落呈鮮紅色或粉紅色，中等大小，直徑1.0mm～2.5m↓↓（TSI：斜面和底面均變黃或變紅，產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S?！?取O抗原分別與大腸桿菌的O抗原單因子血清進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)。即O抗原和O抗原單因子血清各取混合物作對(duì)照，觀察有無(wú)自凝集現(xiàn)象。玻片凝集試驗(yàn)判定標(biāo)+-a)O抗原單因子定型血清的稀釋：采取倍0.5mL加入第1管，在管內(nèi)反復(fù)吹打6～8清稀釋倍數(shù)分別是1:20，1:40，1:80b)加入抗原：向各支試管中分別加入0.5mLO抗原，此時(shí)血清稀釋倍數(shù)相應(yīng)增大一倍；3)凝集強(qiáng)弱判斷（以“＋”表示確定抗體凝集效價(jià)時(shí)，應(yīng)以出現(xiàn)“++?（50凝集現(xiàn)象?“++++?液體完全透明，100％凝集，管底出現(xiàn)大片的?“+++?液體幾乎透明，75％凝集，管底有明顯的傘狀沉淀，震蕩時(shí)呈小或大絮片狀；7?“++?液體中等混濁，50％凝集，管底有中等量的傘狀沉淀，震蕩時(shí)呈小絮片狀；?“+?液體透明度不明顯，25％凝集，管底有少許不明顯的傘狀沉淀；?“-?抗原抗體不凝集，液體混濁、無(wú)透明度，管底無(wú)傘狀沉淀，但由于菌體自然下沉，管82×PCRMasterMix、超純水、瓊脂糖、10mg/ML溴化乙錠（EB）、TBE緩（10×LoadingBuffer）、相對(duì)分子質(zhì)量Mar豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群PCR鑒定用引物yjaAyjaA-FyjaA-RTspE4.C2-FD.2.2ExPEC的系統(tǒng)進(jìn)化群分9V，電流10