柑橘黃龍病檢測鑒定技術(shù)規(guī)程

DB36江西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB36/×××××—2018柑橘黃龍病檢測鑒定技術(shù)規(guī)程（送審稿）2018—××—××發(fā)布2018—××—××實(shí)施江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布柑橘黃龍病檢測鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了柑橘黃龍病的田間診斷癥狀及實(shí)驗(yàn)室PCR檢測鑒定技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于柑橘類植物感染柑橘黃龍病植株的PCR檢測和鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5040柑桔苗木產(chǎn)地檢疫規(guī)程術(shù)語與定義柑橘黃龍病CitrusHuanglongbing，HLB柑橘黃龍病是由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的一種系統(tǒng)性侵染病害，在田間主要通過柑橘木虱、接穗嫁接、菟絲子傳播，植株感病后主要表現(xiàn)出葉片斑駁狀黃化，果實(shí)沿中軸向一側(cè)歪斜，著色與正常果實(shí)相反，又稱“紅鼻果”，果小質(zhì)劣，是一種重要的檢疫性病害。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction，PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。擴(kuò)增引物Primer人工合成的寡核苷酸序列，用于引導(dǎo)DNA體外擴(kuò)增。擴(kuò)增模板TempletDNA體外擴(kuò)增中所用的待擴(kuò)增的靶標(biāo)序列。電泳Electrophoresis帶電分子在恒壓電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳。利用不同大小的DNA分子在電場中移動速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為DNA電泳技術(shù)。柑橘黃龍病菌的基本信息分類地位：現(xiàn)在獲得廣泛認(rèn)可的分類地位為：變形菌門（Proteobacteria），α-變形菌綱（Alphaproteobacterial），根瘤菌目（Rhizobiales），根瘤菌科（Rhizobiaceae），韌皮部桿菌屬（'CandidatusLiberibacter'）。現(xiàn)今共發(fā)現(xiàn)三個種與植物上柑橘黃龍病的發(fā)生相關(guān)，分別為韌皮部桿菌亞洲種'CandidatusLiberibacterasiaticus'（CaLas），韌皮部非洲種'CandidatusLiberibacterafricanus'和韌皮部桿菌美洲種'CandidatusLiberibacteramericanus'，目前這三個種均沒有廣泛有效的方法獲得人工純培養(yǎng)，我國病區(qū)及江西省內(nèi)廣泛流行的病原菌為其中的CaLas。柑橘黃龍病的其他信息請參看附錄A。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了針對韌皮部桿菌亞洲種和非洲種的PCR檢測方法。方法原理柑橘黃龍病的病原菌屬難培養(yǎng)菌，目前尚無廣泛有效的方法進(jìn)行人工培養(yǎng)，因此不可以通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法來鑒定病害。根據(jù)韌皮部桿菌亞洲種的16S核糖體序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，采取病原菌特異性DNA片段體外PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)行檢測，使樣品中所帶的微量特異病原菌DNA序列多次快速擴(kuò)增，最終通過凝膠電泳分離技術(shù)檢測出特異性的DNA條帶來判斷檢測樣品是否攜帶柑橘黃龍病病菌。6?田間癥狀識別柑橘黃龍病的田間癥狀具有一定復(fù)雜性，可出現(xiàn)葉片斑駁狀黃化，缺素狀黃化，均勻黃化，果實(shí)著色異常，樹勢減弱等。較為可靠的診斷癥狀為：葉片上出現(xiàn)的斑駁狀黃化和掛果期出現(xiàn)的“紅鼻果”癥狀，具體癥狀特征見附錄。葉片斑駁狀黃化和“紅鼻果”癥狀可以作為黃龍病田間診斷的判斷標(biāo)準(zhǔn)，但如果要最終確診，需要對疑似樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室PCR檢測。7?樣品采集與保存7.1?實(shí)地取樣產(chǎn)地檢疫，田間實(shí)地取樣參照GB5040.7.2?葉片樣品疑似癥狀植株樣品取樣，優(yōu)先挑取疑似癥狀葉片。若未發(fā)現(xiàn)疑似葉片，即按照樹冠東、南、西、北四個方向采集，每點(diǎn)取中下部成熟葉片五片，每棵樹共采集葉片20張。種苗取樣時(shí)優(yōu)先挑取疑似癥狀植株，沒有發(fā)現(xiàn)疑似癥狀時(shí)可按照抽檢方規(guī)定抽檢率隨機(jī)抽取規(guī)定棵樹植株，每株種苗抽取中下部成熟葉片10片。7.3?果實(shí)樣品幼果期采樣時(shí)，每個植株按照東、南、西、北四個方向采集幼果，切取果柄、果蒂。商品鮮果取樣時(shí)每批次果實(shí)隨機(jī)抽取10個果實(shí)，取果實(shí)中柱。7.4?樣品的保存采集的樣品分別用樣品袋進(jìn)行分裝，可放入適量的濕報(bào)紙進(jìn)行樣品的保濕，做好每個樣品的記錄，將樣品記錄和樣品一并3天內(nèi)寄送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)室對于接收樣品進(jìn)行登記編號，存放于4℃條件下，及時(shí)進(jìn)行樣品DNA核酸抽提。8?分子檢測及主要的設(shè)備儀器和試劑8.1?主要的設(shè)備儀器8.1.1?高壓滅菌鍋。8.1.2?水浴鍋。8.1.3?高速臺式冷凍離心機(jī)。8.1.4?通風(fēng)櫥。8.1.5?微量可調(diào)移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。8.1.6?冰箱（冷藏室4℃和冷凍室-20℃）。8.1.7?超凈工作臺。8.1.8?PCR擴(kuò)增儀。8.1.9?電泳儀電源及水平電泳槽。8.1.10?凝膠成像系統(tǒng)。8.2?主要試劑除非另有說明，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。8.2.1?十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）。8.2.2?十二烷基硫酸鈉（SDS）。8.2.3?乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na）。8.2.4?三羥甲基氨基甲烷（TrisBase）8.2.5?聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。8.2.6?TritonX-100。8.2.7?蛋白酶K。8.2.8?TaqDNA聚合酶。8.2.9?dNTP[10mM]。8.2.10?標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量。8.3?樣品的預(yù)處理與核酸抽提8.3.1?樣品的預(yù)處理對于疑似癥狀的樣品，每份挑取5片葉片。使用一次性刀片，切取葉片的葉柄及葉片基部主脈部分，每份樣品取樣重量控制在0.3g左右。疑似果實(shí)取樣時(shí)，將果實(shí)剖開，切取果實(shí)的中柱部分，取樣重量控制在0.3g左右。8.3.2?樣品的DNA提取樣品DNA的提取按照以下步驟進(jìn)行。1）取1.5mL離心管加入抽提液900μL，蛋白酶K10μL，放入水浴鍋中，55℃～65℃?zhèn)溆茫?）將稱取好樣品，放入研缽中加入液氮充分研磨，直至成細(xì)粉，迅速轉(zhuǎn)入水浴離心管中并用力搖勻，水浴30～40min，中間每隔10min顛倒混勻2次；3）13000rpm離心1min，吸取上清液，加入等體積的Tris-酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），輕柔顛倒混勻呈乳濁狀，室溫下靜置至少10min；4）13000rpm離心3min，吸取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），輕柔顛倒混勻，靜置至分層；5）13000rpm離心2min，吸取上清液，加1/10體積的醋酸鈉溶液，再加入等體積的異丙醇溶液，輕柔顛倒混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫靜置10min；6）2000rpm離心20s，去上清，加入75%乙醇溶液漂洗2～3次；7）最后一次漂洗時(shí)，12000rpm離心1min，收集沉淀，放置金屬浴上55℃干燥沉淀至半透明狀；8）加入120～200μL1×TE溶液，手指輕彈溶解沉淀，也可使用金屬浴55℃助溶，短暫離心10s收集溶液，放入－20℃貯存?zhèn)溆谩?.4?抽提樣品DNA的PCR擴(kuò)增8.4.1?柑橘黃龍病的PCR檢測體系見表1，體系總體積25μL。表1.柑橘黃龍病PCR檢測體系試劑（Reagent）每管用量（(Volume，μL）10×PCRBuffer4.510μmol/L上游引物0.410μmol/L下游引物0.410mmol/LdNTPs0.35U/μLrTaqDNA聚合酶0.3ddH2O18.1模板1.0合計(jì)25引物采用韌皮部桿菌亞洲種特異引物對：OI1/OI2c，引物序列為：OI1：GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA，OI2c：GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT。PCR反應(yīng)程序：95℃，預(yù)變性，3min，95℃，變性，30s，64℃，退火，30s，72℃，延伸，1min20s，35個循環(huán)，72℃，延伸7min。檢測同時(shí)設(shè)陰性對照和陽性對照。8.4.2?瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物電泳程序：取5～7μLPCR產(chǎn)物，加3μL6×loadingbuffer，充分混合后，上樣于1.0%瓊脂糖膠膠孔中，100V，電泳30min，經(jīng)EB染色后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。9?結(jié)果判定田間癥狀觀察作為一種輔助診斷手段。待檢樣品核酸經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳于凝膠成像系統(tǒng)觀察，凝膠上陽性對照出現(xiàn)一條約1160bp的特異性條帶，陰性對照沒有任何擴(kuò)增條帶。待檢樣品若出現(xiàn)與陽性對照相同大小的1160bp特異性條帶，則判定該樣品為陽性，即攜帶柑橘黃龍病病原菌，若未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，則判定樣品為陰性，即未攜帶柑橘黃龍病病菌。附錄（資料性附錄）1?柑橘黃龍病癥狀1.1?柑橘黃龍病葉片癥狀葉片斑駁狀黃化：從葉片基部、中脈兩側(cè)葉肉或葉片邊緣開始出現(xiàn)黃化，形狀不規(guī)則，邊界模糊，與正常綠色組織相互融合在一起，形成斑駁狀的褪綠黃化（圖.1）。圖.1?柑橘黃龍病葉片癥狀1.2?柑