臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-熒光免疫技術(shù)

第八章

熒光免疫技術(shù)

Fluoroimmunoassay,FIA?概念：是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法。

?方法：

熒光抗體技術(shù)(FAT):用熒光素標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位、定量檢測等。

熒光免疫技術(shù)

第一節(jié)

熒光免疫試驗(yàn)的組成要素

1.熒光：某些物質(zhì)受到一定波長光的激發(fā)后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出的波長大于激發(fā)光波長的光。

2.產(chǎn)生機(jī)制：

基態(tài)---能量(波長短的光)----激發(fā)態(tài)---熒光(波長長的光，光致發(fā)光)---基態(tài)

一、熒光的基本知識

化學(xué)物質(zhì)

基態(tài)

吸收能量

釋放能量：發(fā)光

激發(fā)態(tài)

3.特點(diǎn)：

即時(shí)性(停止供能，熒光現(xiàn)象即止10-7～10-8s）

4.能量來源：光、化學(xué)物質(zhì)、射線。

1.發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長，在不同波長下所記

錄到的樣品發(fā)射熒光的相對強(qiáng)度。

2.激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光

激發(fā)樣品,所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。

3.熒光效率：是指熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成

為熒光的百分率。

熒光效率＝發(fā)射熒光的光量子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/

吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)有關(guān)參數(shù)

取決于熒光色素本身的物理特性

4.熒光的淬滅：

指熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退的現(xiàn)象。

原因：

(1)紫外光照射長；

(2)苯胺、酚、ＫＩ、鐵、汞、鎳等。

有利：猝滅劑消除不需要的熒光,如硝基苯

處理有熒光的鏡油。

保存：避光、避免與其它化學(xué)物質(zhì)接觸

二、熒光物質(zhì)

(一)熒光色素：具有光致熒光的特性。

1、熒光色素應(yīng)具備的條件P87

①能與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，結(jié)合蛋白質(zhì)后不易解離，而未

與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易被清除

②熒光效率高

③熒光的顏色與背景組織的顏色對比鮮明

④結(jié)合蛋白質(zhì)后，不影響蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)及免疫

學(xué)活性，而且標(biāo)記方法簡單、快速，結(jié)合物穩(wěn)

定，易于保存。

⑤安全無毒，不具有附加的抗原性。

2、常用的熒光色素：

(1)異硫氰酸熒光素(FITC）

?最大吸收光譜:490-495nm。

?最大發(fā)射光譜:520-530nm。

?熒光顏色:黃綠色。

?應(yīng)用最廣：

①人眼對黃綠色較橘色更為敏感。

②

一般切片等標(biāo)本中綠色的自發(fā)熒光少于紅色的，本底低

。

?缺點(diǎn)：易猝滅

(2)四乙基羅丹明(RB200)

?最大吸收光譜:570nm。

?最大發(fā)射光譜:595-600nm。

?熒光顏色:亮橙、橘紅色。

?應(yīng)用：

常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧??？勺鳛镕ITC的補(bǔ)充，但其熒光效率較低。

(3)四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)

?最大吸收光譜:550nm。

?最大發(fā)射光譜:620nm。

?熒光顏色:橘紅色。

?應(yīng)用：

常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?/p>

激發(fā)峰和熒光距離較大，易于選擇濾光系統(tǒng)。

(4)藻紅蛋白（

PE）

?最大吸收光譜:565nm。

?最大發(fā)射光譜:575nm。

?熒光顏色:橙色。

?應(yīng)用：

常可作為FITC的補(bǔ)充。

(二)其他熒光物質(zhì)

1、鑭系螯合物

?銪(Eu3+)（應(yīng)用最廣）、

鋱(Tb3+)、鈰(Ce3+)的螯合物

?應(yīng)用：熒光衰變時(shí)間長，用于時(shí)間分辨熒光免疫測定

2、酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)(熒光底物)?如堿性磷酸酶（4-甲基傘酮磷酸鹽）、辣根過氧化物酶（對羥基苯乙酸）的底物。

?應(yīng)用：酶免疫熒光分析

3、花菁染料(CyanineDyes，Cy2，Cy3，Cy5）

熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。

Cy2比FITC更穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度更大，光穩(wěn)定性和抗淬滅性更好。

Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。

Cy5的缺點(diǎn)是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。

熒光顯微鏡觀察

1、熒光顯微鏡

1）光源：（供能作用）用短波長的光源

提供很強(qiáng)的激發(fā)光源

高壓汞燈：波長不連續(xù)：365nm～435nm(紫外光或藍(lán)紫光)

只能用作熒光激發(fā)光源

氙燈

鹵素?zé)?/p>

光源有一定壽命：標(biāo)本要集中觀察

2）濾片系統(tǒng)：

①激光濾片（exciterfilter）：

位置：光源和物鏡之間

作用：使短波長的光通過、吸收長波長的光

紫外光濾片：UG通過275nm～400nm

阻擋400nm以上的可見光

組織的自發(fā)熒光弱,呈灰藍(lán)色

藍(lán)紫外光濾片：BG通過325nm～500nm

熒光強(qiáng)度大,適于觀察細(xì)菌標(biāo)本;

不適于觀察有自發(fā)熒光的組織標(biāo)本

②阻擋濾片（barrierfilter）：吸收濾片或抑制濾片

位置：物鏡和目鏡之間

作用：使熒光通過(410～650nm)

阻斷熒光以外的其它光。保護(hù)眼睛。

OG(橙黃色)：

GG(淡綠色)：

③隔熱濾片

位置：燈室聚光器前

作用：阻攔紅外線

3）鏡頭:需消色差、無熒光

4）光路:

透射式：適于觀察對光可通透的標(biāo)本

落射式：適于觀察透明度不好及各種活性組織

一、抗體要求

純度高、特異性強(qiáng)、親和力高、效價(jià)高（雙擴(kuò)效價(jià)≥1：32）

第二節(jié)

熒光抗體的制備

二、熒光素要求

①攪拌法:

用于標(biāo)記體積大,Pr含量高的Ab溶液。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)記時(shí)間短、熒光素用量少（10μg

FITC/1mgIg）

缺點(diǎn)：非特異性熒光高

逐滴加入FITC溶液

攪拌4～6h離心

抗體溶液

三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

②透析法：蛋白質(zhì)含量低，樣品體積小。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)記均勻，非特異性熒光低。

缺點(diǎn)：時(shí)間長，熒光素用量多

TITC抗體溶液

FITC標(biāo)記

的抗體溶液

反應(yīng)過夜

PBS③

影響因素

溫度和時(shí)間：

pH：8.8～9.5蛋白含量：20～25mg/mL蛋白為宜

熒光素的純度：不應(yīng)低于75%四、

熒光標(biāo)記抗體的純化

①除去未結(jié)合的游離熒光素及其降解產(chǎn)物:減少非特異性染色的來源

透析法、凝膠過濾色譜法

②去除過度標(biāo)記和未結(jié)合熒光素的抗體：

離子交換層析（攪拌）

③非特異反應(yīng)物質(zhì)的去除：以同一正常組織／同種動(dòng)物其它組織的組織粉預(yù)先吸收，使非特異熒光大為減弱。

?抗體效價(jià)(高者特異熒光強(qiáng)，非特異熒光相對減弱)

雙擴(kuò)抗體效價(jià)：1：16～1:32比較理想。

?抗體特異性:吸收試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)

?熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比例（F/P）P50

固定標(biāo)本的熒光抗體：F/P=1.5為主

用于活細(xì)胞染色的抗體：F/P=2.4為主

五、

標(biāo)記抗體的鑒定

六、熒光抗體的保存

低溫、避光，防止抗體失活及熒光素的脫落和淬滅

第二節(jié)

免疫熒光試驗(yàn)

熒光抗體(已知Ab)＋切片標(biāo)本(未知Ag)

去除未結(jié)合的熒光Ab

熒光顯微鏡下觀察是否有特異熒光

（一）標(biāo)本的制作

1、材料：細(xì)胞、微生物、組織

要求：

①

標(biāo)本片盡量薄，以利于抗原抗體的接觸、結(jié)合和鏡檢。

②

盡可能保持Ag的完整性，并保證在染色、洗滌和封埋過程中不發(fā)生溶解、變性或脫落，也不擴(kuò)散到臨近細(xì)胞或組織間隙中去。

③

標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，對有傳染性的標(biāo)本要注意實(shí)驗(yàn)室生物安全。

2、玻片和蓋玻片的處理

3、制片

①

涂片：細(xì)胞、微生物可用此法。

②

印片：組織標(biāo)本用此法。

③

切片：組織標(biāo)本用此法（目前少用）。

4、固定

目的：防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落；

去除防礙抗原抗體結(jié)合的類脂；

易于保存。

常見的固定方法

1、染色方法

（1）直接法：測抗原。

標(biāo)本片+特異熒光抗體（已知）

（2）間接法：測抗體、抗原

①已知（或未知）抗原固定（制片）

②加待測抗體（或已知抗體）

③加熒光標(biāo)記的第二抗體。

（二）熒光抗體染色與結(jié)果判斷

直接法

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便

特異性高

非特異性熒光染色少

缺點(diǎn)：敏感度偏低

檢測每一種抗原需制備相應(yīng)的熒光抗體

應(yīng)用：病原微生物的快速檢測

活檢標(biāo)本的免疫病理檢查

間接法：

優(yōu)點(diǎn)：敏感度高于直接法

制備一種熒光抗體可用來檢測多種抗原

既可用于檢測抗原，也可檢測抗體

缺點(diǎn)：易出現(xiàn)非特異性熒光

方法較麻煩

操作時(shí)間較長

應(yīng)用：自身抗體的檢測

FITCRB200Ａ

Ｂ

雙標(biāo)記法

（3）雙標(biāo)記染色法

2、非特異性熒光

來源：自發(fā)熒光

熒光抗體的非特異性熒光色素

抗原不純

染色方法不當(dāng)

控制：①高質(zhì)量純化免疫原、免疫血清及

標(biāo)記后的抗體

②在熒光染色時(shí)設(shè)置對照

3、各種染色法需設(shè)置的對照

標(biāo)本自發(fā)熒光對照

特異性對照（抑制試驗(yàn)）:標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗

體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體

熒光抗體對照：適于間接法

陽性對照

2、標(biāo)本觀察

染色當(dāng)天觀察。

特異性熒光強(qiáng)度用“+”表示：

（—）

無熒光

（±）極弱的可疑熒光

（+）熒光較弱，但清楚可見

（++）熒光明亮

（+++～++++）熒光閃亮

直接法檢測沙眼