三類常見(jiàn)細(xì)菌性病原檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

1三類常見(jiàn)細(xì)菌性病原檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本文規(guī)定了畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的設(shè)備材料、試劑和培養(yǎng)基、樣品采集保存、細(xì)菌分離鑒定、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)和生物安全措施的要求。適用于畜禽源的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的分離鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1最低抑菌濃度minimalinhibitoryconcentration，MIC在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測(cè)試驗(yàn)中能抑制肉眼可見(jiàn)的微生物生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度。3.2折點(diǎn)breakpoint用于判定測(cè)試菌株敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）和耐藥（Resistant，R）的最低抑菌濃度。3.3微量肉湯稀釋法brothmicrodilutionmethod定量檢測(cè)某種抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的體外抑菌活性的一種標(biāo)準(zhǔn)方法。在藥敏板上設(shè)置一系列的濃度梯度的抗菌藥物，加入待測(cè)菌的菌懸液，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育對(duì)藥敏板進(jìn)行讀數(shù)，分析得到MIC值，經(jīng)過(guò)CLSI的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定待測(cè)菌對(duì)抗菌藥的表型。3.4敏感Susceptible使用推薦劑量的抗菌藥物時(shí)，菌株可被達(dá)到抗菌活性濃度水平所抑制。3.5中介Intermediate分離菌株的MIC接近抗菌藥物在血液和組織中的水平，對(duì)藥物治療的反應(yīng)低于敏感菌株。3.6耐藥Resistant按常規(guī)給藥不能抑制該生長(zhǎng)的菌株，MIC值落在存在微生物耐藥機(jī)制范圍內(nèi)，且臨床療效不可靠。4設(shè)備和材料4.1.1微量移液器（0.5ul~1000ul）4.1.2冰箱（4℃、-20℃和-80℃)4.1.3電子天平（最小稱量0.1mg）4.1.4生化培養(yǎng)箱24.1.5渦旋儀4.1.6生物安全柜4.1.7微生物生化鑒定系統(tǒng)4.1.8PCR儀4.2培養(yǎng)基4.2.1緩沖胨蛋白水4.2.2大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（伊紅美藍(lán)和麥康凱）4.2.3RV肉湯4.2.4SC肉湯4.2.5沙門氏菌顯色培養(yǎng)基4.2.67.5%氯化鈉肉湯4.2.7甘露醇高鹽瓊脂4.2.8B-P瓊脂4.2.9LB肉湯4.2.10MH肉湯4.3質(zhì)控菌株4.3.1大腸桿菌ATCC259224.3.2沙門氏菌ATCC352184.3.3金黃色葡萄球菌ATCC292135樣品采集、保存與運(yùn)送用無(wú)菌生理鹽水或運(yùn)送培養(yǎng)基浸潤(rùn)滅菌棉拭子，伸入家畜直腸或家禽泄殖腔1.5cm~2.0cm，旋轉(zhuǎn)2圈～3圈，立即將棉拭子置于10mL緩沖胨蛋白水培養(yǎng)基中。對(duì)于家畜同時(shí)進(jìn)行鼻腔拭子采集，將無(wú)菌無(wú)菌生理鹽水或運(yùn)送培養(yǎng)基浸潤(rùn)滅菌棉拭子伸入家畜（豬等）鼻腔，旋轉(zhuǎn)2圈～3圈，迅速取出，后續(xù)處理同上。5.2新鮮糞便采集用滅菌棉拭子蘸取新鮮糞便，不應(yīng)沾有泥土或其他污染物，立即將棉拭子及樣品置于10mL運(yùn)送培養(yǎng)基中。5.3盲腸內(nèi)容物采集用滅菌棉拭子蘸取盲腸內(nèi)容物，立即置于10mL運(yùn)送培養(yǎng)基中。5.4羽毛及皮毛樣品用無(wú)菌剪刀剪取畜禽腿部和腹部的羽毛，轉(zhuǎn)入無(wú)菌塑料瓶中。5.5樣品采集記錄樣品采集時(shí)填寫采樣登記表，明確樣品類型和數(shù)量。5.6樣品保存與運(yùn)送樣品應(yīng)在4℃保存，使用冰袋等保溫容器運(yùn)輸，糞便保存時(shí)間不超過(guò)48h。6細(xì)菌分離與鑒定6.1大腸埃希氏菌分離鑒定見(jiàn)附錄D1。6.2沙門氏菌菌分離鑒定見(jiàn)附錄D2。6.3金黃色葡萄球菌分離鑒定3見(jiàn)附錄D3。7藥敏試驗(yàn)7.1菌落培養(yǎng)將質(zhì)控菌與待測(cè)菌轉(zhuǎn)入MH瓊脂，35℃~37℃或42℃培養(yǎng)18-24h，得到單克隆菌落。7.2藥敏板制備將抗菌藥物使用對(duì)應(yīng)溶劑和稀釋劑配制母液，按照倍比稀釋法稀釋至所用濃度梯度，應(yīng)符合附錄A的操作。按照順序加入無(wú)菌微量培養(yǎng)板中，每孔100ul，設(shè)置空白孔、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照孔。7.3菌液制備一次性接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種到MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)，用濁度儀調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，用MH肉湯稀釋100倍，取100ul加入微孔板中。7.4孵育將接種完畢的96孔板置于35℃~37℃或42℃生化培養(yǎng)箱中，孵育16h-20h。7.5結(jié)果觀察和記錄取出藥敏板，在光線良好條件下用肉眼觀察結(jié)果。以肉眼可見(jiàn)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。7.6質(zhì)量控制質(zhì)控菌株的MIC應(yīng)符合規(guī)定。如質(zhì)控菌株MIC不在規(guī)定范圍內(nèi)，則本次試驗(yàn)結(jié)果無(wú)如陰性對(duì)照孔未見(jiàn)渾濁且陽(yáng)性對(duì)照孔渾濁，則該藥敏板結(jié)果有效，可繼續(xù)判讀菌株MIC出現(xiàn)其他現(xiàn)象的，則該藥敏板結(jié)果無(wú)效。7.7結(jié)果判定在試驗(yàn)結(jié)果有效的前提下，繼續(xù)判讀測(cè)試菌株的MIC，判讀完成后進(jìn)行記錄。7.8耐藥性結(jié)果對(duì)于沒(méi)有規(guī)定折點(diǎn)的藥物，報(bào)告其MIC值。8生物安全開(kāi)展細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)符合GB4789.1、GB19489生物安全要求，廢棄物處理應(yīng)嚴(yán)格按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。菌株管理按照《動(dòng)物病原微生物菌(毒)種保藏辦理辦法》執(zhí)行。附錄A（規(guī)范性）抗菌藥物儲(chǔ)備液和工作液的制備與保存A.1抗菌藥物的種類用于監(jiān)測(cè)大腸桿菌和沙門氏菌耐藥性的抗菌藥物有：阿莫西林-克拉維酸、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、氨曲南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、美羅培南、粘菌素、磺胺甲惡用于監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌耐藥性的抗菌藥物有：對(duì)萬(wàn)古霉素、慶大霉素、克拉霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、利福平、苯唑西林、頭孢西丁、恩諾沙星、頭孢噻呋、紅霉素。A.2抗菌藥物貯備液的保存精密稱量抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，按照使用說(shuō)明或根據(jù)EUCAST上的溶劑及稀釋劑配制成最高濃度10倍的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存在-20℃冰箱。A.3抗菌藥物工作液的制備測(cè)試的濃度取決于抗菌藥物和細(xì)菌種類，選擇的范圍應(yīng)該覆蓋MIC終點(diǎn)，具體濃度范表A.1抗菌藥物制備濃度范圍單位：ug/mL大腸桿菌沙門氏菌金黃色葡萄球菌抗菌藥物濃度范圍抗菌藥物濃度范圍抗菌藥物濃度范圍阿莫西林-克拉維酸512-0.5阿莫西林-克拉維酸512-0.5萬(wàn)古霉素256-0.5頭孢他啶256-0.5頭孢他啶256-0.5慶大霉素512-1頭孢吡肟512-0.06頭孢吡肟512-0.06克拉霉素128-0.25頭孢噻肟512-0.06頭孢噻肟512-0.06四環(huán)素512--0.5氨曲南256-0.5氨曲南256-0.5環(huán)丙沙星256-0.25亞胺培南64-0.006亞胺培南64-0.006利福平64-0.06環(huán)丙沙星64-0.01環(huán)丙沙星64-0.01苯唑西林氧氟沙星128-0.03氧氟沙星128-0.03頭孢西丁128-0.25美羅培南64-0.006美羅培南64-0.006恩諾沙星128-0.03粘菌素256-0.12粘菌素256-0.12頭孢噻呋256-0.12磺胺甲惡唑512-0.12磺胺甲惡唑512-0.12紅霉素256-0.12附錄B培養(yǎng)基B.1麥康凱瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基成分表成分重量（g/L）蛋白胨20.0乳糖牛膽鹽5.0氯化鈉5.0中性紅0.075瓊脂pH值7.4±0.225℃用法：稱取本品52.0g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，備用。B.2MH肉湯培養(yǎng)基MH肉湯培養(yǎng)基成分表成分重量（g/L）牛肉粉2.0可溶性淀粉酸水解酪蛋白pH值7.4±0.225℃牛肉粉2.0可溶性淀粉酸水解酪蛋白用法：稱取本品21克，加熱溶解1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，備用。。B.3MH瓊脂培養(yǎng)基MH瓊脂培養(yǎng)基成分表成分重量（g/L）牛肉粉6.0可溶性淀粉酸水解酪蛋白瓊脂25℃用法：稱取本品42.0g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，待冷至50℃,傾入無(wú)菌平皿，備用。采樣記錄表C.1采樣記錄表見(jiàn)表C.1。表C.1采樣記錄表被采樣單位單位名稱采樣地點(diǎn)地址經(jīng)緯度聯(lián)系人聯(lián)系電話采樣單位采樣人員聯(lián)系電話被采樣單位簽章：采樣日期：年月日采樣單位簽章：采樣日期：年月日樣品來(lái)源樣品類型數(shù)量編號(hào)泄殖腔拭子糞便盲腸排泄物羽毛擬分離細(xì)菌類型樣品編號(hào)規(guī)則金黃色葡萄球菌：其他：采樣編號(hào)按照“采樣地-日期-動(dòng)物種類-樣品類型-菌株編號(hào)”的格式進(jìn)行。例如山東省2021年4月雞糞便01號(hào)，編寫為SD202104JF-01。分離菌類型在編號(hào)后加入EC、S和STA代表三種菌屬。養(yǎng)殖信息養(yǎng)殖量用藥情況飼料品牌附錄D大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分離鑒定D.1大腸桿菌的分離與鑒定拭子和糞便樣品先接種于選擇性增菌培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)16-20h，以是否產(chǎn)氣為判定指標(biāo)，產(chǎn)氣的樣品接種大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)37℃孵育后，挑取可疑菌落，再一次純化一代，對(duì)已經(jīng)純化的可疑菌落進(jìn)行PCR鑒定或生化鑒定。D.2沙門氏菌的分離與鑒定沙門氏菌的選擇性增菌可以在RV增菌液或SC增菌液中進(jìn)行，經(jīng)過(guò)42℃孵育后，根據(jù)管內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，接種于沙門顯色培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到37℃孵育，可疑菌落表現(xiàn)出紫色，并再次接種在顯色平板上進(jìn)行