第五章 抗體制藥課件

第五章抗體工程制藥

第五章抗體制藥抗體藥物的生產(chǎn)傳統(tǒng)的方法——抗血清淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)如何獲得需要的淋巴細(xì)胞？如何體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞？第五章抗體制藥1997年全球抗體藥物銷售額為3.1億美元，同期全球藥品銷售額為3028億美元，市場(chǎng)份額為千分之一到2008年，增長(zhǎng)至400億美元，同期全部藥品銷售7730億美元，市場(chǎng)份額提升至5.2%抗體藥物年銷售額復(fù)合增速高達(dá)56%，是總藥品銷售增速的6倍第五章抗體制藥2009年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的6項(xiàng)新的生物制品許可申請(qǐng)中，有4只產(chǎn)品屬于單抗藥物,歐洲7個(gè)第五章抗體制藥2010年強(qiáng)生的抗腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體Remicade銷量達(dá)74億美元羅氏的Rituxan銷售額達(dá)到65億美元羅氏的抗Her-2受體單克隆抗體赫賽?。℉erceptin）銷售額達(dá)到51億美元第五章抗體制藥第一節(jié)抗體藥物概念及其特點(diǎn)

第五章抗體制藥一、抗體藥物概念

通過細(xì)胞工程或基因工程生產(chǎn)的，用于診斷或治療的單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體或免疫偶聯(lián)物統(tǒng)稱為抗體藥物

第五章抗體制藥免疫偶聯(lián)物生物導(dǎo)彈是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼由單克隆抗體與藥物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成第五章抗體制藥第五章抗體制藥二、抗體藥物特點(diǎn)

1.特異性1）與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合2）對(duì)靶細(xì)胞的選擇性2.多樣性1）抗原多樣性2）結(jié)構(gòu)多樣性3）抗體活性的多樣性4）免疫偶聯(lián)物和融合蛋白的多樣性第五章抗體制藥第二節(jié)雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體

1975年，德國(guó)學(xué)者Kohler和英國(guó)學(xué)者M(jìn)ilstein合作研究將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫后的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立了能持續(xù)分泌抗棉樣細(xì)胞抗體的雜交瘤細(xì)胞，從而創(chuàng)立了具有劃時(shí)代意義的新技術(shù)，為此獲得了1984年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)第五章抗體制藥一、抗體的種類

1.多克隆抗體多克隆抗體含有兩層意思：一是有含多個(gè)抗原位區(qū)的大分子刺激產(chǎn)生的、識(shí)別不同抗原位區(qū)的各種抗體；二是由體內(nèi)不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的、可針對(duì)同一抗原位區(qū)的多克隆抗體2.單克隆抗體僅識(shí)別抗原分子上同一抗原位區(qū)的由同一克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體為單克隆抗體第五章抗體制藥傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細(xì)胞第五章抗體制藥二、雜交瘤及雜交瘤技術(shù)

細(xì)胞雜交的含義包括同一細(xì)胞的自融合或是在誘導(dǎo)物的作用下不同細(xì)胞間的融合淋巴細(xì)胞通過融合劑的作用和腫瘤細(xì)胞形成融合的雜交細(xì)胞稱雜交瘤細(xì)胞通過腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的融合，用于某些細(xì)胞特性的研究和生產(chǎn)所期望的免疫分子，稱為雜交瘤技術(shù)第五章抗體制藥目前雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有兩種B淋巴細(xì)胞雜交瘤，即用骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合而制備抗體，也是引用最廣泛的一種T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞融合而制備具有免疫活性的淋巴因子通常人們所述的雜交瘤技術(shù)即知B淋巴細(xì)胞雜交瘤，也可稱為單克隆抗體技術(shù)第五章抗體制藥三、單克隆抗體

單克隆抗體是由一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞和一個(gè)具有分泌抗體能力的B淋巴細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞，通過無性繁殖形成的細(xì)胞系 而獲得的這個(gè)細(xì)胞系的每個(gè)細(xì)胞均具有相同的特性且高度均一，這一細(xì)胞系分泌的抗體均一性極高，活性、亞基、親合力均相同

第五章抗體制藥單克隆抗體的特點(diǎn)

抗體結(jié)構(gòu)高度均一?？贵w分子在結(jié)構(gòu)上高度均一，甚至在氨基酸的序列和空間結(jié)構(gòu)上都相同高度特異性?？贵w識(shí)別的是抗原分子上單一的抗原位區(qū)穩(wěn)定的生產(chǎn)特性。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是可以無性繁殖的細(xì)胞系第五章抗體制藥第三節(jié)

雜交瘤細(xì)胞系的建立

第五章抗體制藥一、免疫B淋巴細(xì)胞的制備

1.抗原凡是能具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)均可制備單克隆抗體，抗原可以是全病毒、亞單位或純化分子，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、脂類等用于制備單克隆抗體的抗原在理論上講，純度要求就可以不高，也可以使混合抗原第五章抗體制藥2.免疫

動(dòng)物的選擇目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系來自BALB/c小鼠和Lou大鼠免疫方法A.體內(nèi)免疫法B.脾內(nèi)免疫法C.體外免疫法第五章抗體制藥二、

骨髓瘤細(xì)胞的選擇

在B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中，主要是用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞，這種細(xì)胞是來自骨髓造血細(xì)胞的一種腫瘤，分泌單一抗體的漿細(xì)胞，并且衰變成不表達(dá)自身抗體或部分表達(dá)常見的骨髓瘤親本細(xì)胞系有Sp2/0，NS-1，Y3，YB2

第五章抗體制藥三、

免疫脾細(xì)胞的制備

經(jīng)免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼球、斷頸等方法處死后，無菌摘取脾臟，研磨制取B淋巴細(xì)胞懸液，經(jīng)氯化銨破碎紅細(xì)胞后，洗滌并調(diào)整到（1～5）X107個(gè)／ml濃度備用

第五章抗體制藥四、

細(xì)胞融合

將免疫脾B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按照（5～10）：1混合后離心取上清，緩慢加入分子量在4000～6000的50％PEG1ml，間隔1分鐘后，緩慢加入無血清培養(yǎng)基，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，分種于96孔板中

第五章抗體制藥五、特異雜交瘤細(xì)胞的選擇

1.雜交瘤細(xì)胞的選擇

融合后，有雜交瘤細(xì)胞有骨髓瘤－B淋巴細(xì)胞、B淋巴瘤細(xì)胞－B淋巴瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞－骨髓瘤細(xì)胞，還有未融合的骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞一般用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行篩選

第五章抗體制藥m核酸補(bǔ)救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶第五章抗體制藥第五章抗體制藥2.特異性抗體的篩選

篩選出的雜交瘤細(xì)胞并不是都能分泌所期望的抗體，所以還要對(duì)雜交瘤細(xì)胞做的二次篩選，即對(duì)所分泌的抗體進(jìn)行檢測(cè)一般地，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，抗體可以達(dá)到每毫升微克級(jí)的水平，目前檢測(cè)方法的靈敏度都可以達(dá)到。實(shí)驗(yàn)室常用的是酶聯(lián)免疫的方法，即ELISA方法

第五章抗體制藥第五章抗體制藥六、雜交瘤細(xì)胞的克隆和建株

1.雜交瘤細(xì)胞的克隆化

2.雜交瘤細(xì)胞系建株

第五章抗體制藥七、單克隆抗體的制備

1.動(dòng)物體內(nèi)誘生法

2.體外培養(yǎng)法

第五章抗體制藥第五章抗體制藥八、單克隆抗體生產(chǎn)的一般流程

第五章抗體制藥體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞免疫純系小鼠，取脾臟細(xì)胞體外融合

HAT選擇培養(yǎng)抗體檢測(cè)，陽性孔克隆化培養(yǎng)，抗體檢測(cè)陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)凍存細(xì)胞，建立細(xì)胞庫體外法制備單克隆抗體體內(nèi)法制備單克隆抗體腹水抗體檢測(cè)第五章抗體制藥第五章抗體制藥第四節(jié)

基因工程抗體

第五章抗體制藥鼠單抗對(duì)人而言有較強(qiáng)得免疫原性，可以產(chǎn)生較強(qiáng)的人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)生產(chǎn)成本比較高，難以大規(guī)模普及應(yīng)用

第五章抗體制藥基因工程抗體優(yōu)點(diǎn)

降低抗體的免疫原性。通過基因工程改造技術(shù)，可以最大程度地降低抗體的鼠源性，降低甚至是消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)

穿透力強(qiáng)?；蚬こ炭贵w分子一般比較小，更容易到達(dá)病灶的核心部位

可以根據(jù)需要，制備多用途的新型抗體

成本降低?？刹捎迷思?xì)胞、低等真核細(xì)胞和植物等多種系統(tǒng)表達(dá)

第五章抗體制藥一、人－鼠嵌合抗體

在基因水平上將鼠源單克隆抗體可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)連接起來并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)，這種抗體稱為人－鼠嵌合抗體

第五章抗體制藥第五章抗體制藥二、鼠單抗可變區(qū)人源化抗體

1.改行(型)抗體將鼠單抗的CDR區(qū)移植到人單抗的骨架區(qū)，就可能使人單抗獲得同鼠一樣的抗體特異性，并可以最大限度地降低鼠單抗的異源性，這樣就得到了改行抗體。這種改造過的抗體也稱CDR移植抗體第五章抗體制藥第五章抗體制藥2.表面氨基酸殘基的人源化――鑲面抗體將鼠單抗可變區(qū)表面暴露的骨架區(qū)氨基酸殘基中改成人源的，就成為了鑲面抗體3.表位印跡選擇表位印跡選擇是一種與高效篩選噬菌體抗體庫技術(shù)相結(jié)合的人源化抗體的方法，可以通過數(shù)輪篩選得到完全人源的抗體第五章抗體制藥三、

小分子抗體

小分子抗體是完整免疫球蛋白的一部分，分子量比較小。1）Fab片段和重組Fab。Fab片段包括重鏈Fd段（可變區(qū)和第一恒定區(qū)）和完整的輕鏈，如果恒定區(qū)片段是人源的，即稱為重組Fab。2）Fv和單鏈抗