第五章 抗體制藥課件

第五章抗體工程制藥

第五章抗體制藥抗體藥物的生產(chǎn)傳統(tǒng)的方法——抗血清淋巴細胞的培養(yǎng)如何獲得需要的淋巴細胞？如何體外培養(yǎng)淋巴細胞？第五章抗體制藥1997年全球抗體藥物銷售額為3.1億美元，同期全球藥品銷售額為3028億美元，市場份額為千分之一到2008年，增長至400億美元，同期全部藥品銷售7730億美元，市場份額提升至5.2%抗體藥物年銷售額復(fù)合增速高達56%，是總藥品銷售增速的6倍第五章抗體制藥2009年，美國FDA批準(zhǔn)的6項新的生物制品許可申請中，有4只產(chǎn)品屬于單抗藥物,歐洲7個第五章抗體制藥2010年強生的抗腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體Remicade銷量達74億美元羅氏的Rituxan銷售額達到65億美元羅氏的抗Her-2受體單克隆抗體赫賽?。℉erceptin）銷售額達到51億美元第五章抗體制藥第一節(jié)抗體藥物概念及其特點

第五章抗體制藥一、抗體藥物概念

通過細胞工程或基因工程生產(chǎn)的，用于診斷或治療的單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體或免疫偶聯(lián)物統(tǒng)稱為抗體藥物

第五章抗體制藥免疫偶聯(lián)物生物導(dǎo)彈是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼由單克隆抗體與藥物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成第五章抗體制藥第五章抗體制藥二、抗體藥物特點

1.特異性1）與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合2）對靶細胞的選擇性2.多樣性1）抗原多樣性2）結(jié)構(gòu)多樣性3）抗體活性的多樣性4）免疫偶聯(lián)物和融合蛋白的多樣性第五章抗體制藥第二節(jié)雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體

1975年，德國學(xué)者Kohler和英國學(xué)者Milstein合作研究將經(jīng)綿羊紅細胞免疫后的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，建立了能持續(xù)分泌抗棉樣細胞抗體的雜交瘤細胞，從而創(chuàng)立了具有劃時代意義的新技術(shù)，為此獲得了1984年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎第五章抗體制藥一、抗體的種類

1.多克隆抗體多克隆抗體含有兩層意思：一是有含多個抗原位區(qū)的大分子刺激產(chǎn)生的、識別不同抗原位區(qū)的各種抗體；二是由體內(nèi)不同淋巴細胞產(chǎn)生的、可針對同一抗原位區(qū)的多克隆抗體2.單克隆抗體僅識別抗原分子上同一抗原位區(qū)的由同一克隆細胞產(chǎn)生的抗體為單克隆抗體第五章抗體制藥傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細胞第五章抗體制藥二、雜交瘤及雜交瘤技術(shù)

細胞雜交的含義包括同一細胞的自融合或是在誘導(dǎo)物的作用下不同細胞間的融合淋巴細胞通過融合劑的作用和腫瘤細胞形成融合的雜交細胞稱雜交瘤細胞通過腫瘤細胞和淋巴細胞的融合，用于某些細胞特性的研究和生產(chǎn)所期望的免疫分子，稱為雜交瘤技術(shù)第五章抗體制藥目前雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有兩種B淋巴細胞雜交瘤，即用骨髓瘤細胞和B淋巴細胞進行融合而制備抗體，也是引用最廣泛的一種T細胞雜交瘤技術(shù)，腫瘤細胞和T細胞融合而制備具有免疫活性的淋巴因子通常人們所述的雜交瘤技術(shù)即知B淋巴細胞雜交瘤，也可稱為單克隆抗體技術(shù)第五章抗體制藥三、單克隆抗體

單克隆抗體是由一個骨髓瘤細胞和一個具有分泌抗體能力的B淋巴細胞融合形成的雜交瘤細胞，通過無性繁殖形成的細胞系 而獲得的這個細胞系的每個細胞均具有相同的特性且高度均一，這一細胞系分泌的抗體均一性極高，活性、亞基、親合力均相同

第五章抗體制藥單克隆抗體的特點

抗體結(jié)構(gòu)高度均一?？贵w分子在結(jié)構(gòu)上高度均一，甚至在氨基酸的序列和空間結(jié)構(gòu)上都相同高度特異性?？贵w識別的是抗原分子上單一的抗原位區(qū)穩(wěn)定的生產(chǎn)特性。產(chǎn)生抗體的細胞是可以無性繁殖的細胞系第五章抗體制藥第三節(jié)

雜交瘤細胞系的建立

第五章抗體制藥一、免疫B淋巴細胞的制備

1.抗原凡是能具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)均可制備單克隆抗體，抗原可以是全病毒、亞單位或純化分子，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、脂類等用于制備單克隆抗體的抗原在理論上講，純度要求就可以不高，也可以使混合抗原第五章抗體制藥2.免疫

動物的選擇目前常用的骨髓瘤細胞系來自BALB/c小鼠和Lou大鼠免疫方法A.體內(nèi)免疫法B.脾內(nèi)免疫法C.體外免疫法第五章抗體制藥二、

骨髓瘤細胞的選擇

在B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)中，主要是用多發(fā)性骨髓瘤細胞作為親本細胞，這種細胞是來自骨髓造血細胞的一種腫瘤，分泌單一抗體的漿細胞，并且衰變成不表達自身抗體或部分表達常見的骨髓瘤親本細胞系有Sp2/0，NS-1，Y3，YB2

第五章抗體制藥三、

免疫脾細胞的制備

經(jīng)免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼球、斷頸等方法處死后，無菌摘取脾臟，研磨制取B淋巴細胞懸液，經(jīng)氯化銨破碎紅細胞后，洗滌并調(diào)整到（1～5）X107個／ml濃度備用

第五章抗體制藥四、

細胞融合

將免疫脾B淋巴細胞和骨髓瘤細胞按照（5～10）：1混合后離心取上清，緩慢加入分子量在4000～6000的50％PEG1ml，間隔1分鐘后，緩慢加入無血清培養(yǎng)基，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入細胞培養(yǎng)液，分種于96孔板中

第五章抗體制藥五、特異雜交瘤細胞的選擇

1.雜交瘤細胞的選擇

融合后，有雜交瘤細胞有骨髓瘤－B淋巴細胞、B淋巴瘤細胞－B淋巴瘤細胞、骨髓瘤細胞－骨髓瘤細胞，還有未融合的骨髓瘤細胞和B淋巴細胞一般用HAT培養(yǎng)液進行篩選

第五章抗體制藥m核酸補救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶第五章抗體制藥第五章抗體制藥2.特異性抗體的篩選

篩選出的雜交瘤細胞并不是都能分泌所期望的抗體，所以還要對雜交瘤細胞做的二次篩選，即對所分泌的抗體進行檢測一般地，細胞培養(yǎng)的上清液中，抗體可以達到每毫升微克級的水平，目前檢測方法的靈敏度都可以達到。實驗室常用的是酶聯(lián)免疫的方法，即ELISA方法

第五章抗體制藥第五章抗體制藥六、雜交瘤細胞的克隆和建株

1.雜交瘤細胞的克隆化

2.雜交瘤細胞系建株

第五章抗體制藥七、單克隆抗體的制備

1.動物體內(nèi)誘生法

2.體外培養(yǎng)法

第五章抗體制藥第五章抗體制藥八、單克隆抗體生產(chǎn)的一般流程

第五章抗體制藥體外培養(yǎng)的骨髓瘤細胞免疫純系小鼠，取脾臟細胞體外融合

HAT選擇培養(yǎng)抗體檢測，陽性孔克隆化培養(yǎng)，抗體檢測陽性克隆擴大培養(yǎng)凍存細胞，建立細胞庫體外法制備單克隆抗體體內(nèi)法制備單克隆抗體腹水抗體檢測第五章抗體制藥第五章抗體制藥第四節(jié)

基因工程抗體

第五章抗體制藥鼠單抗對人而言有較強得免疫原性，可以產(chǎn)生較強的人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)生產(chǎn)成本比較高，難以大規(guī)模普及應(yīng)用

第五章抗體制藥基因工程抗體優(yōu)點

降低抗體的免疫原性。通過基因工程改造技術(shù)，可以最大程度地降低抗體的鼠源性，降低甚至是消除人體對抗體的排斥反應(yīng)

穿透力強?；蚬こ炭贵w分子一般比較小，更容易到達病灶的核心部位

可以根據(jù)需要，制備多用途的新型抗體

成本降低。可采用原核細胞、低等真核細胞和植物等多種系統(tǒng)表達

第五章抗體制藥一、人－鼠嵌合抗體

在基因水平上將鼠源單克隆抗體可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)連接起來并在合適的宿主細胞中表達，這種抗體稱為人－鼠嵌合抗體

第五章抗體制藥第五章抗體制藥二、鼠單抗可變區(qū)人源化抗體

1.改行(型)抗體將鼠單抗的CDR區(qū)移植到人單抗的骨架區(qū)，就可能使人單抗獲得同鼠一樣的抗體特異性，并可以最大限度地降低鼠單抗的異源性，這樣就得到了改行抗體。這種改造過的抗體也稱CDR移植抗體第五章抗體制藥第五章抗體制藥2.表面氨基酸殘基的人源化――鑲面抗體將鼠單抗可變區(qū)表面暴露的骨架區(qū)氨基酸殘基中改成人源的，就成為了鑲面抗體3.表位印跡選擇表位印跡選擇是一種與高效篩選噬菌體抗體庫技術(shù)相結(jié)合的人源化抗體的方法，可以通過數(shù)輪篩選得到完全人源的抗體第五章抗體制藥三、

小分子抗體

小分子抗體是完整免疫球蛋白的一部分，分子量比較小。1）Fab片段和重組Fab。Fab片段包括重鏈Fd段（可變區(qū)和第一恒定區(qū)）和完整的輕鏈，如果恒定區(qū)片段是人源的，即稱為重組Fab。2）Fv和單鏈抗