櫻桃無病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)范DB41-T 873-2013

DB41

河南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB41/T873—2013

櫻桃無病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationforpropagatiomofvirus-freeseedingofcherry

2013-12-25發(fā)布2014-02-25實(shí)施

河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

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前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由河南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙改榮、李明、劉聰利、黃貞光、李玉紅。

I

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櫻桃無病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)范

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了櫻桃無病毒苗木繁育技術(shù)的術(shù)語和定義、無病毒原種圃和母本圃的建立、無病毒苗木

繁育、病毒檢測(cè)及監(jiān)測(cè)、苗木出圃。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于櫻桃無病毒苗木的繁育。

1規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB5040柑橘苗木產(chǎn)地檢疫規(guī)程

GB/T12943蘋果無病毒母本樹和苗木檢疫規(guī)程

NY/T328蘋果無病毒苗木繁育規(guī)程

2術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

2.1

櫻桃無病毒苗木

不攜帶李矮縮病毒(Prunedwarfvirus,PDV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus,

PNRSV)、櫻桃小果病毒（Littlecherryvirus,LChV）、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherrygreenringmottlevirus,

CGRMV）、櫻桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、櫻桃壞死銹斑病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus,

CNRMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)的櫻桃苗木。

2.2

櫻桃無病毒原種

經(jīng)有資質(zhì)的專業(yè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)，確定不攜帶本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定病毒的原始植株。

2.3

櫻桃無病毒母本圃

用于提供櫻桃無病毒枝條、種子等繁殖材料的圃地。

3無病毒原種圃的建立

3.1脫毒材料母株要求

選取已經(jīng)進(jìn)入盛果期，經(jīng)3年以上觀察，品種純正、生長(zhǎng)健壯、外觀無異常的植株作為待脫毒材料。

3.2脫毒

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莖尖培養(yǎng)脫毒法參見附錄A，熱處理脫毒法參見附錄B。待脫毒材料可直接經(jīng)過病毒檢測(cè)，篩選無

病毒材料。

3.3無病毒原種的確定

應(yīng)經(jīng)有資質(zhì)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)認(rèn)證，確定不帶上述7種病毒后，即可作為無病毒原種進(jìn)行保存。

3.4無病毒原種保存

原種保存圃與普通果園或苗圃應(yīng)相距100m以上、搭建300目紗網(wǎng)網(wǎng)室，封閉覆蓋全圃，出入口設(shè)

緩沖間。網(wǎng)室內(nèi)土壤隔離覆蓋。定植在花盆中，盆內(nèi)土壤高溫消毒，每個(gè)無病毒品種應(yīng)保存3株以上，

每株編號(hào)、掛牌標(biāo)識(shí)，繪制定植圖。加強(qiáng)肥水管理，保證樹勢(shì)健壯。

無病毒原種圃常用工具要專用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用70%酒精溶液消毒。工作人員進(jìn)

入無病毒原種圃前更換工作服。

3.5建立檔案

建立櫻桃無病毒原種保存圃檔案。記載品種、砧木的中文名稱、外文名稱、品系、株系；引進(jìn)單位、

來源、時(shí)間，脫毒、病毒檢測(cè)的單位、時(shí)間及每年的觀察記錄等。

4無病毒母本圃建立

4.1無病毒母本圃圃地選擇

母本圃地應(yīng)選擇未曾栽植過果樹的地塊。全圃封閉覆蓋300目紗網(wǎng)，與普通果園或苗圃的距離應(yīng)符

合NY/T328的規(guī)定。

4.2無病毒母本圃設(shè)計(jì)規(guī)劃

建圃前按品種采穗圃、砧木采種圃和無性系砧木圃進(jìn)行區(qū)劃。設(shè)計(jì)好排灌系統(tǒng)、道路、建筑物等，

并進(jìn)行土地平整、土壤改良和土壤消毒。

4.3無病毒母本圃苗木來源

無病毒母本圃所采用的繁殖材料應(yīng)全部直接來自櫻桃無病毒原種保存圃。準(zhǔn)確記載品種、砧木、原

母株株系；脫毒、病毒檢測(cè)的單位、時(shí)間等。

4.4無病毒母本圃定植

無病毒品種采穗圃和砧木采種圃株行距為1m～2m×2m～4m；無性系砧木圃株行距為0.5m～

1m×2m～3m。按品種成行栽植，同一品種栽植在一起，定植后繪制定植圖，做好標(biāo)記，不得混雜。

每株母本樹都要賦予唯一的編號(hào)。編號(hào)由品種名稱、原種圃母株株系編號(hào)和本株的編號(hào)共同組成。按照

編號(hào)給每株母本樹掛牌。

4.5無病毒母本圃管理

4.5.1加強(qiáng)母本圃肥水管理和病蟲害防治，保證樹勢(shì)健壯，無早期落葉現(xiàn)象。

4.5.2無病毒無性系砧木圃的樹體，應(yīng)每年短截更新，其方法與普通無性系砧木母株相同。不允許在

母本圃嫁接。

4.5.3無病毒母本圃常用工具要專用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用70%酒精溶液消毒。

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5無病毒苗木繁育

5.1苗圃建立

5.1.1苗圃地選擇

選擇地勢(shì)平坦，排灌方便，土壤肥沃，壤土、沙壤土質(zhì)，土壤酸堿度適中，沒有栽植過果樹及果樹

苗木的地方。苗圃與普通果園、苗圃的距離應(yīng)符合GB5040的規(guī)定，或全圃封閉覆蓋100目防蟲網(wǎng)、

與普通果園及苗圃距離應(yīng)符合GB/T12943的規(guī)定。

5.1.2苗圃規(guī)劃和建設(shè)

苗圃應(yīng)劃分為若干小區(qū)。規(guī)劃出實(shí)生苗播種區(qū)、無性系砧木繁殖區(qū)、成苗培養(yǎng)區(qū)等。按規(guī)劃設(shè)計(jì)出

各級(jí)道路、排灌系統(tǒng)，并統(tǒng)籌安排。平整土地，改良土壤，土壤消毒及增施有機(jī)肥。

5.2實(shí)生砧木苗培育

砧木種子應(yīng)采自無病毒母本圃。采種后標(biāo)記其母株編號(hào)，并即刻沙藏，秋季或早春播種。播種前施

用殺菌劑和殺蟲劑，進(jìn)行土壤消毒。播種時(shí)按照母株編號(hào)分別播種，并繪制各株系分布圖，田間插牌標(biāo)

記，不得混雜。其他管理同普通苗圃。

5.3無性系砧木苗培育

5.3.1材料來源

無性系砧木繁殖材料，應(yīng)來自無病毒母本圃。繁殖材料應(yīng)分別掛牌標(biāo)記其母株編號(hào)，按照品種及母

株編號(hào)分別繁殖。繪制各品種及株系分布圖，田間插牌標(biāo)記，不得混雜。

5.3.2繁殖方法

5.3.2.1壓條、分株繁殖法

從無病毒母本圃植株上直接進(jìn)行壓條、分株繁殖的砧木自根苗，在苗圃栽植后再埋干壓條繁殖無病

毒砧木苗。

5.3.2.2組織培養(yǎng)法

組織培養(yǎng)方法繁殖砧木苗木，繼代次數(shù)不超過7代。

5.3.2.3扦插繁殖法

用綠枝扦插、硬枝扦插等方法繁殖無病毒砧木。

5.4嫁接

5.4.1接穗采集

接穗應(yīng)采自無病毒母本圃。采集接穗的枝條生長(zhǎng)健壯、芽體飽滿、無落葉、無病害。采集的接穗應(yīng)

在陰涼處立即剪去葉片。按品種扎成捆，掛牌標(biāo)記母株編號(hào)。接穗存放同普通櫻桃接穗。

5.4.2嫁接

應(yīng)分品種及不同母株分別嫁接。采用帶木質(zhì)部芽接法嫁接，嫁接位置距地面10cm～20cm處。嫁

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接后應(yīng)按品種及母株編號(hào)分別記載。補(bǔ)接時(shí)，應(yīng)與原來嫁接的接穗來源相同。

5.5苗圃管理

加強(qiáng)土肥水管理與病蟲害防治，保持苗木健壯生長(zhǎng)、無早期落葉現(xiàn)象。

6病毒檢測(cè)及監(jiān)測(cè)

6.1病毒檢測(cè)方法

6.1.1木本指示植物檢測(cè)法

李矮縮病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒、櫻桃小果病毒、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒、櫻桃壞死銹斑病毒、蘋果褪

綠葉斑病毒可以采用木本指示植物檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟參見附錄C。

6.1.2酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

能獲得抗血清的櫻桃病毒可以采用A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（PAS-ELISA）進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟參

見附錄D。

6.1.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)法

李矮縮病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒、櫻桃小果病毒、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒、櫻桃病毒A、櫻桃壞死銹斑

病毒、蘋果褪綠葉斑病毒均可以采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)法(RT-PCR)方法進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟

參見附錄E。

6.2無病毒原種的監(jiān)測(cè)

無病毒原種圃的每株樹，經(jīng)常進(jìn)行田間目測(cè)（參見附錄F），每年經(jīng)國(guó)家有資質(zhì)的病毒檢測(cè)單位進(jìn)

行一次病毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)攜帶病毒植株，應(yīng)連同容器立即清除。

6.3無病毒母本圃的監(jiān)測(cè)

在生長(zhǎng)期，應(yīng)每月對(duì)無病毒母本圃植株的表現(xiàn)癥狀進(jìn)行全面的觀察（參見附錄F），發(fā)現(xiàn)異常立即

檢測(cè)。每2年對(duì)每株母本樹進(jìn)行一次病毒檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)帶毒植株立即清除，并進(jìn)行局部土壤消毒。

6.4無病毒苗木監(jiān)測(cè)

7.4.1每年在生長(zhǎng)季節(jié)對(duì)無病毒苗木進(jìn)行兩次全面觀察，發(fā)現(xiàn)有病毒癥狀（參見附錄F），立即拔除

帶毒植株及相鄰植株。

7.4.2每年苗木出圃前，應(yīng)進(jìn)行1次病毒檢測(cè)，1‰抽檢，隨機(jī)取樣。若檢測(cè)出病毒，根據(jù)編號(hào)進(jìn)行追

溯，對(duì)其母本樹進(jìn)行檢測(cè)。若母本樹帶毒，應(yīng)將帶毒母本樹繁殖的所有苗木及相鄰苗木銷毀或按普通苗

木處理；若母本樹不帶毒，將攜帶病毒苗木及相鄰苗木銷毀，或按普通苗木處理。

7苗木出圃

7.1苗木出圃時(shí)間

宜在苗木停止生長(zhǎng)、葉片開始脫落至翌年春季萌芽前出圃。土壤上凍時(shí)不要挖苗。

7.2苗木檢疫

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挖苗前，應(yīng)到縣、區(qū)植物檢疫站進(jìn)行檢疫，并辦理檢疫證書。

7.3挖苗

在挖苗前一天把即將落葉的苗木葉片全部抹除（帶葉栽植除外）。苗木主要根系要挖齊全，盡量減

少根系和苗干受傷。苗木挖好后，應(yīng)及時(shí)分級(jí)、扎捆、掛標(biāo)簽和假植。

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A

附錄A

（資料性附錄）

微莖尖培養(yǎng)法脫毒技術(shù)

A.1早春，從預(yù)選的植株上隨機(jī)切取剛萌動(dòng)變綠尚未展葉的飽滿芽，或3～5月剪取抽生的嫩莖尖，去

葉后作為外植體。

A.2用洗滌劑水浸3min后，流水沖洗10min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)上，70%酒精浸泡6s，2%次氯酸鈉滅

菌10min～20min，無菌水沖洗3次。

A.3解剖鏡放置在超凈臺(tái)上，用棉球蘸消毒酒精擦拭手及臺(tái)面，點(diǎn)燃酒精燈，將大小鑷子灼燒消毒。

將鋪有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿放置在解剖鏡臺(tái)上，用鑷子取出A.1切取的材料，利用解剖針在解剖鏡下

剝除其外部葉原基，切取1.0mm以下莖尖分生組織(帶1～2片葉原基)，用無菌濾紙吸干水。

A.4將外植體接種于接種培養(yǎng)基（表A.1、表A.2）上，25℃恒溫培養(yǎng)，每天光照2000lx～3000lx

14h，黑暗10h，誘導(dǎo)叢生芽。

表A.1MS培養(yǎng)基配方

單位為毫克/升

類型成分濃度

硝酸鉀KNO31900

硝酸銨NH4NO31650

大量元素

磷酸二氫鉀KH2PO4170

硫酸鎂MgSO4·7H2O370

氯化鈣CaCl2·2H2O440

乙二胺四乙酸二鈉Na2·EDTA·2H2O37.3

鐵鹽硫酸亞鐵FeSO4·7H2O27.8

碘化鉀KI0.83

硼酸H3BO36.2

硫酸錳MnSO4·4H2O22.3

微量元素

硫酸鋅ZnSO4·7H2O8.6

鉬酸鈉Na2MoO4·2H2O0.25

硫酸銅CuSO4·5H2O0.025

氯化鈷CoCl2·6H2O0.025

肌醇100

甘氨酸2

有機(jī)成分鹽酸硫胺素VB10.1

鹽酸吡哆醇VB60.5

煙酸0.5

蔗糖30000

其他水解乳蛋白200

瓊脂6000

注：pH值5.8。

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表A.2櫻桃砧木（ZY-1）培養(yǎng)基

單位為毫克/升

種類基本培養(yǎng)基BAIBANAA

接種培養(yǎng)基MS0.30.1-

繼代培養(yǎng)基MS0.40.4-

生根培養(yǎng)基1/2MS(大量元素減半)--0.5

A.5叢生芽生長(zhǎng)到1cm～3cm高時(shí)，重復(fù)A.3，切取0.3mm以下莖尖分生組織，接種在接種培養(yǎng)基

上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽。

A.6將叢生芽或帶1～2個(gè)芽的莖端轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2～3周后，取苗高2cm以上的新梢轉(zhuǎn)移

到生根培養(yǎng)基上，弱光處理5d后，轉(zhuǎn)入光下誘導(dǎo)生根。

A.7將試管苗移栽于溫室，成活后檢測(cè)。

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BA

附錄B

（資料性附錄）

熱處理法脫毒技術(shù)

B.1櫻桃品種盆栽苗脫毒

將盆栽苗放入人工氣候室，光照強(qiáng)度10000lx以上，32℃起始溫度下預(yù)培養(yǎng)3d后，黑暗溫度恒

定32℃，白晝溫度每天增加1℃，達(dá)到37℃時(shí)，保持在白晝37℃16h/d、黑暗32℃8h/d、濕

度60%～80%條件下，變溫?zé)崽幚?8d。剪取新梢頂部0.5cm～1.0cm，嫁接到無病毒砧木上，成活后

檢測(cè)。

B.2櫻桃砧木試管苗脫毒

選擇繼代培養(yǎng)4～5代增殖能力強(qiáng)的無性系，熱處理方法參見B.1變溫處理18d后，剝?nèi)?.4mm

大小莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)和繼代擴(kuò)繁，并進(jìn)行檢測(cè)。

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CB

附錄C

（資料性附錄）

木本指示植物溫室檢測(cè)法

C.1早春取無病毒砧木苗，栽植于直徑15cm、高25cm的花盆中，花盆中的基質(zhì)經(jīng)過高溫消毒，置

于溫室內(nèi)，溫室溫度白天20℃～28℃，夜間9℃～15℃。

C.29月份或翌年春季砧木發(fā)芽期，從待檢株上剪取接穗，并對(duì)待檢株進(jìn)行編號(hào)和記錄，寫好標(biāo)牌，

綁縛在待檢接穗上。

C.3從指示植物母本樹上剪取接穗。

C.4采用二重芽接法，先把待檢接穗的芽片嫁接在砧木基部，每株嫁接1個(gè)芽。同時(shí)削取指示植物的

芽片嫁接在待檢芽的上方，兩芽相距1.0cm～2.0cm。每個(gè)待檢樣品重復(fù)嫁接4盆～5盆，掛好標(biāo)牌。

嫁接后，溫室溫度控制在18℃～26℃，同時(shí)注意防治害蟲和控制萌蘗生長(zhǎng)。

C.5春季苗木發(fā)芽前，在指示植物接芽的上方約1.0cm～1.5cm處剪砧。及時(shí)除萌，保證待檢芽和指

示植物芽萌發(fā)，并用摘心的方法控制待檢芽的生長(zhǎng)。

C.6從5月中下旬開始至9月末，定期觀察指示植物的癥狀表現(xiàn)，做好觀察記錄，根據(jù)指示植物的癥

狀參照表C.1，鑒定帶毒狀況。

表C.1六種櫻桃病毒在木本指示植物上的主要癥狀

病毒種類指示植物主要癥狀

李矮縮病毒白普賢、GF305、愛爾伯特（Elberta）、樹勢(shì)衰弱，簇葉、葉黃化、花葉、褪綠壞死環(huán)斑、

shirofugen、kwanzan葉細(xì)長(zhǎng)、畸形

李屬壞死環(huán)斑病毒白普賢、GF305、shirofugen、kwanzan壞死葉斑，脫落形成穿孔，流膠，接芽壞死

櫻桃小果病毒拉姆伯特（Lambert)、塞姆（Sam）、凱葉片邊緣微卷，發(fā)病葉片在夏末和秋季變?yōu)榧t色或

彌柯斯（cannidex）青銅色，果實(shí)著色不完全，斑點(diǎn)，個(gè)小，畸形

櫻桃綠環(huán)斑駁病毒白普賢、shirofugen、kwanzan葉片黃化、次脈周圍暗色斑駁

櫻桃壞死銹斑病毒塞姆（Sam）褐色壞死葉斑，銹狀褪綠葉斑

蘋果褪綠葉斑病毒GF305、愛爾伯特（Elberta）葉片出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，葉小，植株矮化，長(zhǎng)勢(shì)弱

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DC

附錄D

（資料性附錄）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

D.1溶液配制（均用蒸餾水）

D.1.1包被緩沖液（pH9.6100mL）

Na2CO30.159g

NaHCO30.294g

D.1.2提取緩沖液（0.05mol/LpH8.2Tris-HCl緩沖液100mL）

0.2mol/LTris25mL

0.1mol/LHCl22.5mL

蒸餾水補(bǔ)足100mL

D.1.3洗滌緩沖液（PBSTpH7.41000mL）

NaCl8.0g

NaH2PO4·12H2O2.9g

K2HPO40.2g

KCl0.2g

NaN30.2g

Tween-200.5mL

D.1.4抗原提取緩沖液

PBST+2%聚乙烯吡咯烷酮+0.2%卵蛋白(或牛血清蛋白BSA)

D.1.5底物緩沖液（pH5.0100mL）

檸檬酸1.019g

NaH2PO4·12H2O8.689g

D.1.6酶底物

10mL底物緩沖液+4mg鄰苯二胺

D.1.7終止液（2mol/LH2SO4100mL）

36%濃硫酸11.2mL

D.2A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（PAS-ELISA）

D.2.1包被A蛋白：用包被緩沖液稀釋A蛋白純品，檢測(cè)工作濃度為1μg/mL～5μg/mL，酶聯(lián)反應(yīng)

板每孔100μL，37℃保溫2h，倒掉孔中液體后，用PBST洗板3～4次，每次靜置3min～5min。

D.2.2加第一抗體：用PBST稀釋抗體至工作濃度，每孔加100μL，保溫和沖洗方法同D.2.1。

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D.2.3加抗原樣品，取櫻桃嫩葉或一年生休眠枝條內(nèi)皮層，每克樣品加入5mL抗原提取液，研磨后

8000r/min離心10min，取上清液，每孔加100μL，每樣品2孔，每個(gè)微孔板需同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空

白對(duì)照。4℃冰箱過夜，沖洗方法同D.2.1。第一次沖洗液不得溢出。

D.2.4加第二抗體：用PBST稀釋抗體至工作濃度，每孔加100μL，保溫和沖洗方法同D.2.1。

D.2.5加酶標(biāo)A蛋白：市售辣根過氧化物酶標(biāo)A蛋白用PBST稀釋至工作濃度，每孔加100μL，保溫

和沖洗方法同D.2.1。

D.2.6加底物：每孔加100μL，黑暗中室溫放置15min～30min顯色。

D.2.7終止反應(yīng)：每孔加25μL2mol/LH2SO4終止反應(yīng)。

D.2.8目測(cè)比色后，用酶標(biāo)光度計(jì)測(cè)定讀數(shù)，波長(zhǎng)492nm，OD值大于2倍陰性對(duì)照值（即P/N>2）

可判為陽性。

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ED

附錄E

（資料性附錄）

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)法

E.1十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液配制

2%CTAB（W/V），4%PVP（W/V），100mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0），25mmol·L-1EDTA（pH8.0），

5mol·L-1NaCl，混合滅菌121℃15min，滅菌后加入體積分?jǐn)?shù)2%的2-巰基乙醇。

E.2CTAB法提取總RNA

E.2.1取100mg～200mg櫻桃新鮮嫩葉，研缽中加液氮研磨成粉末狀，迅速轉(zhuǎn)入1.5mLEppendorf

管中，加入600μL的提取緩沖液，混勻，4℃，12000r/min，離心15min。

E.2.2小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：l)溶液，混勻，4℃，12000r/min，

離心15min。

E.2.3小心吸取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇(24：l)溶液，混勻，4℃，12000r/min，離心10

min，重復(fù)l次～2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止。

E.2.4取水相，加入2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3mol/LNaAc(pH5.3)，混勻，-20℃放置3

h，4℃，12000r/min，離心15min。棄去上清液，用70%無水乙醇洗滌，沉淀2次。

E.2.5室溫下干燥5min后，溶于30μL～50μLTE或DEPC處理純水中，-20℃或-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

E.3反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

E.3.1DNAaseI消化

為了去除RNA樣品中可能存在的基因組污染，向離心管中加入0.5μL～1μLRRI（RNA酶抑制劑）、

1μLDNAaseI、2μL10×DNAaseIBuffer和16μLRNA，用槍頭混勻后37℃溫浴30min，75℃5min，

離心2min后置于冰上冷卻。1.5%瓊脂糖膠檢測(cè)RNA質(zhì)量，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

E.3.2反轉(zhuǎn)錄

取上述RNA0.1μg～5μg、0.2μg/μL隨機(jī)六聚體引物（或特異性引物）1μL，加適量DEPC-ddH2O

至12μL，70℃溫浴5min后置于冰上冷卻，依次加入20U/μLRNA酶抑制劑1μL、10mmol/LdNTP2

μL、5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，25℃溫浴5min，加入200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶1μL，42℃溫浴1h，70℃10

min，終止反應(yīng)，離心，-20℃保存，即為cDNA模板，稀釋8倍后用于PCR擴(kuò)增。

E.4PCR擴(kuò)增

0.2mLPCR管中依次加入下列成分：cDNA模板2μL，病毒特異性引物及內(nèi)參基因RPII正反向引

-1

物（10μM，引物序列參見表E.1）各1μL，dNTPs（2.5μM）2μL，10×PCRbuffer2μL，MgCl（22.5mmol·L）

-1

1.6μL，Taq酶（5U·μL）0.2μL，加ddH2O補(bǔ)足20μL體系。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃5min；

94℃50s，60℃（可根據(jù)引物退火溫度作適當(dāng)調(diào)整）50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；

4℃保存60min。

E.5結(jié)果判定

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檢測(cè)時(shí)以陽性植株為陽性對(duì)照，無病毒組培苗及ddH2O為陰性對(duì)照，以內(nèi)參基因RPII檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操

作的準(zhǔn)確性。采用1.5%瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，觀察到與陽性對(duì)照相同的目的條帶的樣品為陽性，

帶毒性；與陰性對(duì)照ddH2O一樣，未觀察到目的條帶的樣品為陰性，無病毒；與陰性對(duì)照無病毒組培

苗一樣，觀察到內(nèi)參基因RPII條帶，但未觀察到目的條帶的樣品為陰性，無病毒。

表E.1七種病毒及內(nèi)參基因RT-PCR檢測(cè)特異性引物序列

病毒種類引物引物序列片段長(zhǎng)度

PNRSV-FACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA

449bp

PNRSVPNRSV-RTGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG

PDV-FTAGTGCAGGTTAACCAAAAGGAT

172bp

PDVPDV-RATGGATGGGATGGATAAAATAGT

LChV2-FTCCGAATAGTCAGTTCAAAG

337bp

LChV2LChV2-RAATAGCCCTCATAAATCTCC

CGRMV-FCCTCATTCACATAGCTTAGGTTT

958bp

CGRMVCGRMV-RACTTTAGCTTCGCCCCGTG

CNRSV-FTCCCACCTCAAGTCCTAGCAG

584bp

CNRSVCNRSV-RTGAACTTGGCCAGTTCTGCC

ACLSV-FTTCATGGAAAGACAGGGGCAA

309bp

ACLSVACLSV-RAAGTCTACAGGCTATTTATTATAAGTCTAA

CVA-FAGCCAGAAGGTATCATGCCAG

556bp

CVACVA-RATGACATGCCTGCTGGGAG

RPII-FTGAAGCATACACCTATGATGATGAAG

195bp

內(nèi)參基因RPIIRPII-RCTTTGACAGCACCAGTAGATTCC

13

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FE

附錄F

（資料性附錄）

病毒病樹體表現(xiàn)癥狀

F.1李矮縮病毒（Prunedwarfvirus,PDV）常見的危害癥狀

可引起櫻桃枝干從上向下干枯，出現(xiàn)簇葉、葉黃化、花葉、葉細(xì)長(zhǎng)、畸形等，病葉也會(huì)產(chǎn)生褪綠壞

死環(huán)斑，有時(shí)與PNRSV的癥狀相似。

F.2李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV）常見的危害癥狀

葉片上出現(xiàn)黃綠色至綠色環(huán)斑、褪綠斑、壞死斑，環(huán)斑內(nèi)部組織壞死脫落形成穿孔，孔洞邊緣退綠

并微微突起。有時(shí)產(chǎn)生碎葉、帶狀葉、粗花葉、耳突等。

F.3櫻桃小果病毒（Littlecherryvirus,LChV）常見的危害癥狀

典型癥狀有葉片邊緣輕微卷曲，發(fā)病葉片在夏末和秋季變?yōu)榧t色或青銅色，侵染果實(shí)會(huì)使果實(shí)不能

完全成熟，著色不完全，產(chǎn)生斑點(diǎn)，果實(shí)小，畸形，收獲時(shí)期果實(shí)只有正常果實(shí)的1/2至1/3大小。受

影響的果實(shí)呈現(xiàn)暗紅色，三角狀，口味下降，果實(shí)成熟過晚等癥狀。

F.4櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV）常見的危害癥狀

感染酸櫻桃導(dǎo)致葉片黃化、次脈周圍暗色斑駁等癥狀，在甜櫻桃及其他李屬作物上為潛隱性病毒，

侵染后通常無癥狀。

F5櫻桃病毒A(CherryvirusA,CVA)常見的危害癥狀

是典型的潛隱性病毒，不能直接從植物器官的為害癥狀進(jìn)行識(shí)別，與其他病毒混合侵染后會(huì)加重危

害，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，葉片畸形、細(xì)長(zhǎng)等。

F6櫻桃壞死銹斑病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus,CNRMV)常見的危害癥狀

葉片出現(xiàn)褐色壞死斑、銹狀褪綠斑。

F7蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)常見的危害癥狀

為潛隱性病毒，被侵染的植株開始無明顯癥狀，2年～3年后出現(xiàn)葉片褪綠、砧穗嫁接不親和、枝

條稀疏、生長(zhǎng)衰退等癥狀。夏季環(huán)斑處壞死并形成穿孔，葉片支離破碎，直至脫落。某些品種果實(shí)縫合

線處有裂口，可溶性固形物含量降低，果實(shí)品質(zhì)下降。

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前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由河南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙改榮、李明、劉聰利、黃貞光、李玉紅。

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