第十八章 細胞衰老與死亡課件

第十八章細胞衰老與死亡第十八章

細胞衰老與凋亡第十八章細胞衰老與死亡細胞衰老與凋亡衰老是指年齡老化及其器官或細胞功能的衰退。它是生物的基本特征，是不以人的意志為轉(zhuǎn)移的自然規(guī)律。

時光流逝歲月不饒人青春永駐長命百歲現(xiàn)代人類面臨的三種衰老：心理性衰老生理性衰老病理性衰老現(xiàn)代人類面臨的三種衰老：生理性衰老病理性衰老現(xiàn)代人類面臨的三種衰老：生理性衰老第十八章細胞衰老與死亡細胞衰老與凋亡衰老及其機制細胞凋亡機體和組織器官的衰老衰老的機制基因的調(diào)控作用細胞凋亡檢測技術細胞凋亡與疾病第十八章細胞衰老與死亡第一節(jié)衰老及其機制

概念：正常環(huán)境下發(fā)生的細胞的生理功能和增殖能力的減弱，以及細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并趨向于死亡的現(xiàn)象，又稱老化。后果：機體衰老、老年病人體的代謝功能是由不同的組織細胞相互配合共同完成的。這種互補性造成了不同組織細胞相互依存的現(xiàn)象，某一組織細胞功能衰退將直接或間接影響到其他組織細胞功能。因此，對高等動物或人體來說，衰老發(fā)生在整體水平。第十八章細胞衰老與死亡第一節(jié)衰老及其機制

細胞衰老的特征：細胞內(nèi)多種酶的活性降低，細胞膜的通透性改變，物質(zhì)運輸?shù)墓δ芙档汀＃ò装l(fā)）細胞內(nèi)色素增多，妨礙細胞內(nèi)物質(zhì)的交流和傳遞。（老年斑）細胞內(nèi)水分減少，細胞萎縮，體積變小。（皺紋）一、機體和組織器官的衰老第十八章細胞衰老與死亡第一節(jié)衰老及其機制

從細胞和分子水平闡述衰老的機制的學說已達300余種，目前比較盛行的是

差錯/損害學說、遺傳程序?qū)W說、自由基學說。二、衰老的機制第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（一）差錯/損害學說

1963年Orgel提出“差錯成災”學說，認為在機體細胞合成蛋白質(zhì)時，轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程中隨時可發(fā)生差錯，有個別氨基酸錯誤的摻入蛋白質(zhì)（種類、位置），因而產(chǎn)生出差錯的蛋白質(zhì)或差錯的聚合酶。如果差錯出現(xiàn)在酶的活性中心，將引起酶活性或特異性聚合酶功能上的改變，繼而產(chǎn)生有差錯的DNA或RNA，在此基礎上又繼續(xù)產(chǎn)生新的差錯。如此循環(huán)下去，在差錯堆積成災時則使機體代謝障礙，導致衰老。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制根據(jù)中心法則的推斷，認為在DNA復制，轉(zhuǎn)錄和翻譯中隨時可能發(fā)生差錯，這種差錯可以不斷擴大，造成細胞衰老、死亡。如DNA轉(zhuǎn)錄mRNA的過程發(fā)生微小的差異，帶有該微小差異的mRNA會翻譯出進一步偏離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)如果屬于DNA聚合酶會合成差異程度更大的DNA，這樣的差錯經(jīng)過每一次信息傳遞都擴大一些，形成惡性循環(huán)，使細胞內(nèi)積累許多差錯分子造成災難，細胞正常功能不能發(fā)揮，致使細胞衰老、死亡。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制Smith提出交聯(lián)假說認為，機體中蛋白質(zhì)、核酸等大分子可以通過共價交叉結(jié)合，形成巨大分子。這些巨大分子難以酶解，堆積在細胞內(nèi)。隨著增齡，在有害因子自由基的作用下，交聯(lián)反應增多，又不能及時修復，損害細胞的正常功能，生物分子的理化性質(zhì)就會發(fā)生改變，導致衰老。這種交聯(lián)反應可發(fā)生于細胞核DNA鏈之間，也可以發(fā)生在DNA與蛋白質(zhì)之間和膠原纖維之間。交聯(lián)學說在本質(zhì)上并未超出“差錯成災”學說的范圍，只不過是對其做了進一步的說明和解釋。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制實驗表明，從Wistar系老年大鼠（18月齡）和年輕大鼠（5月齡）的研究中發(fā)現(xiàn)，取鼠肝提取DNA，測其溶解溫度和增色效應，取鼠尾腱分別測定膠原纖維收縮起始溫度、膠原蛋白含量及可溶性膠原含量，發(fā)現(xiàn)大鼠衰老后DNA交聯(lián)損傷增加，膠原纖維交聯(lián)損傷增加。實驗結(jié)果對“差錯成災”的有力支持，但也有很多實驗結(jié)果不支持此學說。隨著分析方法的改進和分析技術的提高，目前認為衰老細胞中出現(xiàn)的DNA和蛋白質(zhì)的改變，大部分是隨細胞衰老出現(xiàn)的變化而不是細胞衰老的原因。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制線粒體DNA（mtDNA）與衰老和某些老年性疾病關系的研究，近期發(fā)展較快。研究認為，mtDNA突變造成線粒體氧化磷酸化功能障礙，能量產(chǎn)生不足與器官老化和多種老年性疾病有關。mtDNA是由堿基對構(gòu)成的雙股環(huán)狀DNA，一條為輕鏈，一條為重鏈，均有編碼功能，其編碼的產(chǎn)物涉及氧化磷酸化所需的細胞色素b、細胞色素c，NADH脫氫酶亞單位等。mtDNA因不與組蛋白結(jié)合，所以易受活性氧等自由基侵害，造成氧化損傷，另外由于其內(nèi)不含內(nèi)含子，沒有修復系統(tǒng)，所以任何形式的突變均可能影響線粒體的功能。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制mtDNA突變有3種類型：點突變、缺失、重復突變。有人認為這3中突變方式都可能導致人和動物的衰老和疾病的發(fā)生。大量研究表明，mtDNA缺失突變較為普遍，引起的后果較嚴重。有資料證明，人心臟和腦細胞中mtDNA多缺失5.0kb和7.4kb片段，且隨年齡增加明顯增加。35歲以前幾乎檢測不到mtDNA缺失，63~74歲缺失片段比35歲增長14倍，80歲又比63~74歲增高4倍。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制mtDNA突變不僅與衰老有關，而且會導致多種老年病。有人認為mtDNA的結(jié)構(gòu)特點使其容易受到自由基侵害，導致突變，引起細胞代謝出現(xiàn)異常，mtDNA損傷積累越來越多，正常細胞呼吸鏈被干擾，與呼吸有關的酶系統(tǒng)退化，氧化磷酸化作用越來越弱，并出現(xiàn)缺陷，結(jié)果導致神經(jīng)退化性疾病如帕金森病、阿爾海默病，大腦、骨骼肌、腎和內(nèi)分泌腺等退化性疾病的發(fā)生和加劇。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（二）遺傳程序?qū)W說20世紀60年代，由Hayflick等提出，該學說的基本觀點認為，衰老與發(fā)育、生長和成熟相似，都是由遺傳基因調(diào)控的程序化過程所控制，按照一定的時間順序所表現(xiàn)出來的生命現(xiàn)象。不同種屬生物有不同的壽命是由各自的遺傳基因所決定的。（機體壽命與細胞壽命相關性）近年來，隨著端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)和研究的深入，為這一學說豐富了內(nèi)容。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制端粒是真核細胞染色體自然末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，起著固定DNA雙螺旋，防止DNA鏈被解開的作用。人類端粒由位于染色體末端的重復序列(TTACCG)n及一些結(jié)合蛋白所組成。1986年，Cooke發(fā)現(xiàn)，每次細胞分裂后，其端粒就縮短一些，直至最后其減少至幾十個bp。此時若細胞進一步分裂會導致染色體的磨損，因而細胞進入黃昏時期直到最終死亡。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制研究表明，端粒具有重要的作用，端粒決定了細胞的壽命，因為DNA復制過程中，與模板3‘端配對的引物降解后，沒有上游引物延長序列填補。所以，DNA每復制一次，端粒即丟失50~200bp，當它縮短到一定程度時，細胞則停止分裂，進而衰老、死亡。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制端粒序列的復制依賴于一種特殊的DNA聚合酶，即稱為端粒酶的核蛋白酶。該酶能夠合成端粒DNA，修復被損傷了的端粒并使其延長，但機制仍然不是十分清楚，有待進一步研究。在85%~95%的常見腫瘤細胞中，存在高表達的端粒酶活性，而在大多數(shù)正常細胞中，一般測不到端粒酶活性。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制有研究發(fā)現(xiàn)，在未分化的成纖維細胞中，細胞分裂次數(shù)越多，端粒長度越短。隨著細胞衰老，血液及結(jié)腸粘膜細胞中端粒平均長度也不斷縮短。胚胎細胞、永生化細胞和其他一些表達端粒酶活性的干細胞壽命均比無端粒酶活性的細胞長。因而有人認為端粒的縮短是啟動衰老的分子鐘，端粒失去DNA這一過程向細胞發(fā)出信號以停止其分裂，從而決定細胞有限的生命時限。細胞衰老的端粒假說雖然被大多實驗研究證明，但并不是在所有細胞中都適用，人角膜內(nèi)皮細胞就不受端粒酶的影響。盡管端粒和端粒酶的研究并不能解釋所有的衰老機制，但它卻是是衰老-抗衰老研究領域的一項重要內(nèi)容，如延長細胞生命或腫瘤的發(fā)生。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（三）自由基學說（國際公認學說）1954年Harman提出了衰老的自由基學說，他認為衰老過程中的退行性變化是由于細胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基的有害作用造成的。其反應能力很強，可使細胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害細胞的正常功能。還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，影響其正常功能。生物體的衰老過程是機體的組織細胞不斷產(chǎn)生的自由基積累結(jié)果，自由基可以引起DNA損傷從而導致突變，誘發(fā)腫瘤形成。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制自由基及其衍生自由基是指具有未配對電子的原子、原子團、離子、基團或分子，他們的共同特征是最外層的電子不成對，這有別于過渡性金屬電子層內(nèi)層存在的不成對電子，后者不屬于自由基，沒有強氧化作用。自由基包括羥自由基、氯原子、超氧陰離子、NO分子等，是參與人體內(nèi)氧化還原反應的最重要最廣泛的的反應成分。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制活性氧是指從氧衍生出來的自由基及其產(chǎn)物，不僅免疫細胞能釋放大量活性氧，許多正常細胞和癌細胞也同樣能釋放活性氧。產(chǎn)生的主要部位是線粒體的電子傳遞鏈上泛半醌/細胞色素b區(qū)域產(chǎn)生超氧陰離子自由基與過氧化氫。實驗表明，人的成纖維細胞在5%~95%氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)，細胞壽命縮短；將成纖維細胞放在含特丁基氫過氧化物的培養(yǎng)基中數(shù)分鐘，可加速細胞衰老。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制通過對大量研究結(jié)果的深入分析，人們發(fā)現(xiàn)最大壽命與抗氧化力/活性氧生成量呈相關性。由此看出，提高抗氧化力和降低活性氧生成量都有助于延長壽命，但這并不是充足條件，提高抗氧化力/活性氧生成量的比值才是滿足延長最大壽命的條件。自由基學說與前兩種學說有交叉，在差錯/損壞學說中，利用自由基的作用解釋蛋白質(zhì)或核酸交聯(lián)產(chǎn)生的原因以及線粒體損傷的原因；在端粒研究中，稍高氧壓下與正常氧壓下培養(yǎng)細胞，端粒縮短速率增快。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（四）細胞凋亡學說細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。衰老是具有累積性、漸進性、內(nèi)生性的生命過程。在衰老過程中，機體各組織器官功能逐漸衰退和喪失，最終死亡。細胞凋亡是維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因控制的細胞自主的有序性死亡，與衰老過程中組織器官功能的退化、衰老相關疾病的發(fā)生密切相關。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制差錯理論認為，導致衰老的誘因來自于外界，差錯缺乏修復或不可修復，差錯累積，造成衰老，認為衰老是一種被動過程。而程序理論認為，衰老是細胞自發(fā)的，主動的過程，由基因程序按照“生物鐘”的安排所決定。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自由基也參與細胞凋亡。在諸種細胞凋亡的誘因中，體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生活性氧自由基如O2﹣

、OH﹣

、H2O2等被證實可誘導細胞凋亡。羥自由基可引起蛋白質(zhì)氧化、DNA鏈斷裂、細胞膜發(fā)泡等，這些正是細胞凋亡的特征。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制維爾納綜合征（Werner’ssyndrome）是一種遺傳性成年早老癥，是編碼一種類似DNA解旋酶的基因發(fā)生突變所致，研究表明其患者Fas基因介導的淋巴細胞凋亡大大增加。阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)退行性疾病，β淀粉樣蛋白在腦中的沉積，可增加胞內(nèi)鈣離子濃度，造成神經(jīng)細胞凋亡；AD患者腦內(nèi)細胞丟失可能與細胞凋亡有關。氧自由基也參與老年癡呆的病理過程，腦內(nèi)缺乏保護性抗氧化物質(zhì)，容易受氧自由基攻擊，氧自由基可能通過細胞凋亡來加重對AD的損傷。第十八章細胞衰老與死亡成人早衰癥

第十八章細胞衰老與死亡嬰幼兒早衰癥

第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制不同的細胞由不同的基因調(diào)控凋亡的發(fā)生。與細胞分化和衰老有關基因誘導細胞凋亡的有：c-fos、e-jun、c-myc、P53、Rb、Fas等，抑制細胞凋亡的有：Bcl-2、AdeovirusE3基因等。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（五）體細胞突變學說由Failla于1958年提出，該學說認為體細胞中的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，結(jié)果使其形態(tài)、功能失調(diào)，引起衰老發(fā)生。形象的說，體細胞的衰老是由于某種衰老性的“打擊”造成的，如同衰老之箭擊中了細胞內(nèi)的靶子而導致衰老。此學說有其局限之處，細胞突變不一定指向衰老。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（六）免疫功能下降學說該學說認為，由于免疫系統(tǒng)功能下降或異常導致其他器官、細胞的功能異常，引起衰老。免疫功能異常確實與衰老的表現(xiàn)有非常密切的關系，但是確定免疫系統(tǒng)功能異常與衰老之間的因果關系，仍需進一步深入研究。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（七）內(nèi)分泌功能降低學說也稱其為神經(jīng)內(nèi)分泌階段式調(diào)節(jié)學說，是衰老學說中重要的一種，該學說認為，衰老的內(nèi)分泌系統(tǒng)有一個中樞在大腦。腦內(nèi)有一組控制身體功能而使其他物質(zhì)不能代替的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，如下丘腦-垂體軸。當內(nèi)分泌功能減退時，機體的內(nèi)環(huán)境失去平衡，功能發(fā)生紊亂，代謝出現(xiàn)障礙，衰老隨之而來，嚴重則導致死亡。一些學者認為，衰老不會僅由下丘腦功能的改變或激素調(diào)節(jié)的障礙所致，而是整個內(nèi)分泌器官功能性降低（內(nèi)分泌-神經(jīng)控制系統(tǒng)障礙）的結(jié)果。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（八）有害物質(zhì)積蓄學說該學說中有害物質(zhì)是指脂褐素，因而也稱脂褐素學說。細胞中脂褐素隨年齡增加而增多是一個顯而易見的事實。有學者認為脂褐素在細胞中積蓄，擾亂了細胞空間，改變了擴散渠道，影響了亞細胞結(jié)構(gòu)，對細胞產(chǎn)生不良影響，引起衰老。第十八章細胞衰老與死亡(二)衰老的機制（九）微量元素學說微量元素學說是以體內(nèi)必須微量元素含量異常或代謝失調(diào)，非必需的以及有害微量元素過量來解釋衰老的發(fā)生機制。機體通過體內(nèi)的自身平衡機制來保證體內(nèi)微量元素的平衡，保持正常生理狀態(tài)時，可達到自然壽限，如果發(fā)生異常則會導致疾病。一般情況下，人體內(nèi)的必須微量元素隨年齡增加在體內(nèi)逐年增加，故老年人體內(nèi)含量較低；而非必需微量元素和有害微量元素隨年齡增加在體內(nèi)逐年增加。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。細胞脫落離體或裂解為若干由單位膜包裹的凋亡小體，被其他細胞吞噬?，F(xiàn)在很多情況下，細胞凋亡亦成為程序化細胞死亡（PCD）。細胞凋亡的特殊的生物學特征：細胞核的DNA被核酸內(nèi)切酶在核小體單位之間降解，產(chǎn)生若干大小不一的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)DNA“梯形帶”，這些區(qū)帶由180~200個堿基對整數(shù)倍的寡核苷酸片段組成。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡

細胞凋亡和細胞壞死是多細胞生物中細胞死亡的兩種不同形式，它們在形態(tài)學、分子機制和生物學意義等方面有著本質(zhì)的區(qū)別。比較：第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡凋亡細胞的形態(tài)學特征：細胞體積縮小，核染色質(zhì)濃縮呈半月形，胞漿濃縮，線粒體無大變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈泡狀并與細胞膜融合，細胞膜內(nèi)陷將細胞自行分割為多個具有完整的膜結(jié)構(gòu)，不出現(xiàn)溶酶體酶等細胞內(nèi)涵物外泄，故不引起炎癥反應和次級損傷。細胞凋亡是單個細胞的丟失，結(jié)局是被吞噬細胞或鄰近細胞所識別、吞噬。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡細胞壞死的形態(tài)學特征：由于膜通透性增加，細胞外形發(fā)生不規(guī)則變化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核染色質(zhì)不規(guī)則位移，進而線粒體及核腫脹，溶酶體破壞，細胞膜破裂，細胞質(zhì)的內(nèi)容物外溢，引起嚴重的炎癥反應。壞死的細胞常常是成群的細胞一起丟失。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡近年來有人認為，凋亡與壞死沒有絕對的區(qū)別界限，在一定的條件下，凋亡可以轉(zhuǎn)化為壞死。體外實驗發(fā)現(xiàn)，適量的誘導劑可以誘導出細胞凋亡，繼續(xù)增加誘導劑的用量則誘導出壞死的改變。在體內(nèi)，如果凋亡小體不被識別，吞噬功能障礙，不能及時清除凋亡小體，凋亡小體的完整膜結(jié)構(gòu)破壞后，內(nèi)含的溶酶體釋放出來，可引起組織的壞死。凋亡、壞死比較細胞凋亡細胞壞死能量ATP不依賴ATP細胞形態(tài)皺縮腫脹細胞膜完整破裂細胞器形態(tài)完整腫脹破裂細胞核染色質(zhì)凝集斷裂固縮，核膜破裂凋亡小體有無DNA規(guī)律斷裂，梯狀條帶隨機降解分子機制多基因參與，有序調(diào)控無基因調(diào)控蛋白質(zhì)合成有無代謝反應蛋白酶逐次參與無秩序反應周圍組織炎性反應無有對機體的影響生長發(fā)育代謝需要有損傷破壞作用圖A：細胞壞死；圖B,C：細胞凋亡左，正常胸腺細胞；右，凋亡胸腺細胞

細胞凋亡過程A.NormalcellB.ApoptosisC.Apoptoticbodies細胞凋亡細胞壞死炎癥反應第十八章細胞衰老與死亡第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡細胞凋亡是一個正常的生理過程，它對于維持多細胞生物的生命過程中，細胞增殖與細胞死亡的平衡具有至關重要的意義。目前已知，細胞凋亡在動物的機體發(fā)育過程中、在人類免疫系統(tǒng)淋巴細胞分化成熟過程中、在機體清除受損或衰老細胞過程等方面起到重要作用。另外，細胞凋亡還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能由于細胞增殖與細胞死亡速度之間的平衡失調(diào)所致。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡細胞凋亡機制在動物進化過程中高度保守。影響細胞凋亡的基因：一、基因的調(diào)控作用

ICE家族基因Fasc-mycP53Bcl-2第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡（一）ICE酶系家族白介素-1β轉(zhuǎn)換酶（ICE），是一種半胱氨酸蛋白酶，由兩個大亞基和兩個小亞基組成。此酶系家族的前體必須在本身肽鏈的天冬氨酸基團處斷裂加工才具有活性，這類酶本身具有催化肽鏈在天冬氨酸基團斷裂的功能，這表明這類酶可能具有自身加工活化和互相作用加工活化的能力。ICE家族基因的過度表達可誘發(fā)細胞凋亡，在細胞凋亡中起著中心作用。當這類前體活化后，在無蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄的情況下便可誘發(fā)細胞凋亡。第十八章細胞衰老與死亡ICE家族成員（切冬酶基因家族）*第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡（二）FasFas也稱CD95或Apo-1，屬于TNF受體家族成員。這類受體是跨細胞膜的蛋白，膜外是富含絲氨酸的功能區(qū)，膜內(nèi)部分含有被稱為死亡功能域（DD）的傳遞細胞死亡信號的同源功能區(qū)。Fas在各種組織中都表達，尤其是胸腺、肝臟、心臟和腎臟中表達量很大，實驗表明，F(xiàn)as在T淋巴細胞凋亡過程中起作用。Fas和配體結(jié)合后啟動形成三聚體受體，使Fas蛋白的胞質(zhì)部分召集其他幾種蛋白形成一個復合體，稱為死亡起始信號復合體（DISC）發(fā)揮使細胞凋亡的作用。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡（三）c-myc體外實驗已證明，c-myc的重要功能是促進細胞分裂。其過度表達可使細胞不再對生長滯留信號做出反應，并使休眠期的細胞進入繼續(xù)增殖狀態(tài)。體外實驗也發(fā)現(xiàn)，c-myc過表達不僅會促進細胞增殖，也會促進細胞凋亡。目前認為，激活c-myc的轉(zhuǎn)錄同時啟動了細胞增殖和凋亡兩種狀態(tài)，其他信號的參與決定了細胞的選擇方向。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡（四）P53P53蛋白是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)已知它可促進P21、Bax、MDM2、周期素G等至少6個基因的轉(zhuǎn)錄。在細胞中，P53以不具轉(zhuǎn)錄活性的休眠形式存在，接受上游信號后C末端形成的一個開放結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，P53被激活，具有結(jié)合DNA的活性。雖然P53對于正常的有絲分裂和減數(shù)分裂并不是必需的，但P53蛋白的活性和穩(wěn)定性總是以細胞周期相關的方式變化。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡P53介導的下游事件主要有兩個途徑：細胞周期停滯和細胞凋亡。1、細胞周期停滯作為對DNA的應答，P53被激活并影響下游p21基因的轉(zhuǎn)錄，使DNA損傷的細胞停滯在G1期。2、細胞凋亡P53在細胞凋亡啟動中具有重要作用。如輻射P53缺乏鼠，其胸腺細胞、小腸和大腸的干細胞不會發(fā)生凋亡。對病毒或細胞癌基因表達以及缺失關鍵性抑癌基因Rb時做出應答，引起細胞凋亡。第十八章細胞衰老與死亡第二節(jié)細胞凋亡（五）Bcl-2Bcl-2基因（長壽基因）：抑制凋亡Bcl-2的蛋白產(chǎn)物具有保護多種細胞免于多種誘因所致的細胞凋亡，它是細胞凋亡的重要抑制基因。用微注射法將含有Bcl-2的重組體注入交感神經(jīng)細胞中，使其過量表達，壽命較對照組明顯延長，并發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的衰老細胞能抵抗去除血清所誘導的細胞凋亡。第十八章細胞衰老與死亡bcl-2基因家族*第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述（一）形態(tài)學觀察（二）流式細胞術分析（三）DNA降解分析（四）酶學分析（五）細胞內(nèi)鈣濃度的分析第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述（一）形態(tài)學觀察細胞凋亡的形態(tài)學觀察有普通光學顯微鏡、電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察方法。1、普通光學顯微鏡觀察凋亡細胞的共同特征是細胞容積收縮，以細胞核的形態(tài)改變尤為突出，看不到炎癥反應。在組織內(nèi)，細胞凋亡的典型特征是出現(xiàn)單個細胞，且凋亡細胞周圍有環(huán)狀帶。凋亡細胞體積縮小，染色質(zhì)致密聚集成斑塊狀。染色方法可用HE染色、甲基綠-派洛寧染色或吉姆薩染色。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述2、電子顯微鏡觀察在電子顯微鏡下觀察，開始時凋亡細胞體積縮小，失去細胞連接和一些特殊膜表面結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)靠近核膜，形成新月狀體。然后，核體積進一步縮小，并可裂解為一或數(shù)個致密體，其與一定的核糖體及各種細胞器成分形成具有完整膜性結(jié)構(gòu)的凋亡小體。隨之，凋亡小體由鄰近正常細胞或吞噬細胞識別、吞噬。典型表現(xiàn)為凋亡細胞染色質(zhì)固縮，常靠近核膜呈明顯的塊狀或新月狀小體，胞漿濃縮或裂解成質(zhì)膜包繞的碎片，胞質(zhì)內(nèi)可見完整的細胞器。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述3、熒光顯微鏡觀察經(jīng)吖啶橙染色后，凋亡細胞細胞核或細胞質(zhì)可見致密濃染的黃綠色或枯黃色碎片。細胞壞死時，胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或枯黃色熒光減弱或消失?，F(xiàn)有人利用縮時攝影術對細胞凋亡發(fā)生的整個過程進行動態(tài)觀察，這被認為是檢測細胞凋亡形態(tài)學的“金標準”，因其可排除其他形態(tài)學觀察中，固定所造成的的人為假象而使形態(tài)學指標不能重復。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述（二）流式細胞術（FCM）分析

FCM是當前廣泛應用的一種細胞凋亡的檢測手段，具有快速靈敏、結(jié)果準確客觀、重復性好、可同時檢測多種指標等優(yōu)點?？刹捎枚喾N方法分析細胞凋亡。1、細胞形態(tài)分析2、細胞膜結(jié)構(gòu)與功能的改變3、細胞器改變4、細胞DNA含量分析5、凋亡相關蛋白的分析第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述1、細胞形態(tài)分析凋亡早期細胞體積縮小，形成前相散射（FSC）低，側(cè)相散射（SSC）高的特殊光散射型；細胞凋亡后期，由于染色質(zhì)濃縮和核碎裂致使FSC和SSC均減弱。缺點是由于其他原因引起的細胞形態(tài)改變也可出現(xiàn)這種變化，因而特異性較差。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述2、分析細胞膜結(jié)構(gòu)與功能的改變一種方法是利用細胞膜完整的活細胞對陽離子染料如臺盼藍拒染的特點，區(qū)分活細胞與凋亡細胞。另一種方法是針對細胞凋亡時出現(xiàn)的細胞膜結(jié)構(gòu)的改變，使用熒光素標記的抗體或配體進行染色后，通過流式細胞儀測定。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述3、細胞器改變的分析使用綠色熒光染料羅丹明123（Rh123）作為線粒體探針。細胞凋亡時線粒體膜電位降低，線粒體結(jié)合Rh123能力下降，使用流式細胞儀測定時可見Rh123熒光強度降低。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述4、細胞DNA含量分析這是目前最常用的凋亡分析技術之一，還可以同時分析細胞周期。細胞凋亡時激活核酸內(nèi)切酶，使核小體連接區(qū)出現(xiàn)廣泛DNA斷裂，產(chǎn)生很多小DNA片段。細胞在染色前的處理過程中，細胞膜通透性增加，小片段DNA溢出，再用流式細胞儀測定時，在DNA直方圖上顯示G0/G1峰前出現(xiàn)一個DNA含量減少的亞二倍體峰，亦稱凋亡峰。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述5、凋亡相關蛋白的分析用熒光素標記的單克隆抗體與凋亡相關蛋白相互作用，應用流式細胞儀可定量測定凋亡相關蛋白。6、應用流式細胞儀在混合細胞中分選出凋亡細胞作進一步的研究，是流式細胞術的一個獨特的優(yōu)點。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述（三）DNA降解分析這一檢測方法是基于細胞凋亡時，DNA被核酸內(nèi)切酶降解，形成以180~200bp為最小單位的單體或寡聚體片段的特點而設計的檢測方法。其檢測方法有：1、超速離心DNA進行氯化銫連續(xù)梯度離心，結(jié)合溴化乙啶染色，可看到DNA片段的分帶。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述2、瓊脂糖凝膠電泳此方法是最早用于研究細胞凋亡生物化學改變特性的傳統(tǒng)經(jīng)典方法。典型的細胞凋亡圖譜出現(xiàn)“階梯帶”，壞死細胞為“涂片帶”。將末端標記的DNA電泳后進行放射自顯影，檢驗敏感性可提高至少50倍以上。用此方法研究分析細胞凋亡具有較強的特異性，但不用于定量分析。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述3、TUNEL（DNA斷裂的原位末端標記法）是一種靈敏度和特異性都較高的細胞凋亡檢測技術?？捎糜跈z測細胞懸液、細胞涂片及冷凍或石蠟包埋的組織切片。其基本原理是首先用蛋白酶消化法在標本細胞上打孔，把標本與TdT酶和熒光素或生物素標記的dUTP放在一起溫育，TdT將標記的dUTP連接到凋亡細胞DNA片段的3‘末端，可用流式細胞儀測定或用熒光顯微鏡觀察熒光強度；以生物素作為標記物的需進一步與親和素標記的酶及相應底物作用顯色，用普通光學顯微鏡觀察。第十八章細胞衰老與死亡二、細胞凋亡檢測技術概述（四）酶學分析由于caspase（半胱氨酸天冬氨酸-特異性蛋白酶）在細胞凋亡發(fā)生過程中起到十分關鍵的作用，分析其活性比其他方法更有利于檢測細胞凋亡的早期事件。大多數(shù)caspase的作用底物不是由一種特異的caspase裂解，因此建立檢驗特異性caspase活性的技術方法對于凋亡的檢測有重要意義。（五）細胞內(nèi)鈣離子濃度分析細胞中Ca2﹢濃度的變化是細胞凋亡的一個特征。凋亡早期Ca2﹢濃度快速、持續(xù)升高。第十八章細胞衰老與死亡三、細胞凋亡與疾病腫瘤獲得性免疫缺陷綜合征動脈粥樣硬化細胞凋亡可導致腫瘤獲得性免疫缺陷綜合征動脈粥樣硬化第十八章細胞衰老與死亡三、細胞凋亡與疾?。ㄒ唬┘毎蛲雠c腫瘤腫瘤的發(fā)生是一個非常復雜的過程，我們已知腫瘤的發(fā)生是癌基因的激活與抑癌基因被抑制或失活共同作用的結(jié)果，同時，細胞周期調(diào)控異常也與腫瘤發(fā)生有關，細胞凋亡也與腫瘤關系密切。1、Bcl-2家族在細胞凋亡與腫瘤發(fā)生中的作用現(xiàn)已證明Bcl-2是最重要的抑制腫瘤細胞凋亡的基因，Bcl-2基因的過度表達并不影響細胞增殖和加速細胞分裂，而是阻止腫瘤細胞凋亡，延長腫瘤細胞的生存。第十八章細胞衰老與死亡三、細胞凋亡與疾病2、c-myc在細胞凋亡與腫瘤發(fā)生中的作用c-myc原癌基因是調(diào)控細胞周期的主要基因，其編碼的myc蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，在多數(shù)腫瘤中表達增高。其過量表達給予細胞兩種選擇：死亡或增殖。細胞最終的選擇結(jié)果取決于細胞接受的其他