DB21-T 4043-2024 水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

ICS65.150CCSB50/59DB21TechnicalregulationforproductionofBacillussubtilisforaquaculture遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB21/T4043—2024本文件是按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院。本文件主要起草人：葉博、李石磊、趙振軍、董穎、王旭達(dá)、王笑月、劉桂林、劉丹妮、張乾、曹琛、高學(xué)文、劉煜珺。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門(mén)通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)綜合樓A座），聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院（大連市沙河口區(qū)黑石礁街50號(hào)聯(lián)系電話1DB21/T4043—2024水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）生產(chǎn)中所涉及的術(shù)語(yǔ)和定義、生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備要求、培養(yǎng)基、菌液生產(chǎn)技術(shù)流程、指標(biāo)檢測(cè)和儲(chǔ)運(yùn)的相關(guān)技術(shù)內(nèi)容。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3097海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB3838地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB20287農(nóng)用微生物菌劑GB/T26428飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求3術(shù)語(yǔ)和定義GB20287、GB/T26428確立的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1枯草芽孢桿菌bacillussubtilis芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性菌，一種需氧菌。菌體桿狀，無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。可形成內(nèi)生抗逆芽孢，芽孢呈橢圓或柱形，位于菌體中央或稍偏，形成芽孢后菌體不膨大。生長(zhǎng)、繁殖速度較快，菌落表面粗糙不透明，灰白色或微黃色。3.2初級(jí)菌種theprimarystrain由單菌落接種培養(yǎng)，并通過(guò)甘油冷凍或試管穿刺保藏的菌種。3.3一級(jí)菌種thefirstclassstrain初級(jí)菌種在固體培養(yǎng)基上活化后，挑取單菌落接種至試管裝液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)的菌種。3.42DB21/T4043—2024二級(jí)菌種thesecondclassstrain試管中的一級(jí)菌種，轉(zhuǎn)接至三角瓶裝液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)的菌種。4生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備要求4.1生產(chǎn)環(huán)境應(yīng)符合如下條件：——廠區(qū)空氣質(zhì)量達(dá)到GB3095中二類環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求?！l(fā)酵生產(chǎn)用海水應(yīng)符合GB3097中二類水質(zhì)要求，發(fā)酵生產(chǎn)用淡水應(yīng)符合GB3838中III類水質(zhì)要求，其他用水應(yīng)符合GB3838中IV類水質(zhì)要求?！l(fā)酵生產(chǎn)場(chǎng)地及發(fā)酵相關(guān)設(shè)施應(yīng)符合安全、環(huán)保、消防等條件要求?！l(fā)酵生產(chǎn)場(chǎng)地需配置消毒滅菌設(shè)施。菌種儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作設(shè)備應(yīng)與生產(chǎn)場(chǎng)地相對(duì)隔離并定期消4.2生產(chǎn)設(shè)備采用不銹鋼發(fā)酵罐或PE材質(zhì)發(fā)酵桶，設(shè)備體積根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模自定。5培養(yǎng)基5.1一般要求培養(yǎng)基所使用的原材料應(yīng)滿足菌液生產(chǎn)要求，具體按GB4789.28的規(guī)定執(zhí)行。對(duì)于首次使用的發(fā)酵原料應(yīng)通過(guò)搖瓶或小型發(fā)酵試驗(yàn)后再用于發(fā)酵生產(chǎn)。5.2種子培養(yǎng)基初級(jí)菌種及一級(jí)菌種使用的種子培養(yǎng)基中應(yīng)含有易被菌種吸收利用的碳氮源，營(yíng)養(yǎng)豐富。種子培養(yǎng)基見(jiàn)附錄A中的A.1。5.3發(fā)酵培養(yǎng)基二級(jí)菌種發(fā)酵培養(yǎng)基與擴(kuò)大生產(chǎn)培養(yǎng)基相同，該培養(yǎng)基要求在保證菌種生長(zhǎng)性能的同時(shí)，盡量采用來(lái)源豐富、成本低廉、營(yíng)養(yǎng)緩釋的培養(yǎng)基原料，培養(yǎng)基中還應(yīng)添加緩沖劑穩(wěn)定pH值。發(fā)酵培養(yǎng)基見(jiàn)附錄A中的A.2。5.4固體培養(yǎng)基用于枯草芽孢菌種分離、鑒定及活菌計(jì)數(shù)使用。固體培養(yǎng)基見(jiàn)附錄A中的A.3。6生產(chǎn)技術(shù)流程6.1菌液生產(chǎn)流程具體生產(chǎn)流程見(jiàn)附錄B。3DB21/T4043—20246.2菌種要求應(yīng)滿足如下要求：——用于發(fā)酵的枯草芽孢桿菌應(yīng)明確菌種來(lái)源的相關(guān)信息?！跫?jí)菌種使用前應(yīng)先檢測(cè)純度與狀態(tài)，可涂布固體培養(yǎng)基平板檢查，枯草芽孢桿菌在固體培養(yǎng)基上形成灰白色或微黃色，圓形或蔓延成波浪形、不規(guī)則形的菌落，其表面粗糙、不透明、邊緣擴(kuò)張。具體方法按GB/T26428執(zhí)行?！l(fā)酵罐接種前應(yīng)檢測(cè)上一級(jí)菌種的純度和濃度，不應(yīng)有雜菌污染，菌液濃度應(yīng)達(dá)到1.0×108cfu/mL以上。6.3滅菌方法種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、菌種培養(yǎng)器材、發(fā)酵罐等均需采用高壓濕熱滅菌，滅菌條件為115℃~121℃,0.1MPa～0.15MPa，滅菌20min～30min。滅菌后無(wú)菌操作取培養(yǎng)基染色鏡檢，無(wú)微生物說(shuō)明滅菌徹底。6.4接種方法6.4.1一級(jí)菌種接種接種針經(jīng)火焰滅菌,待冷卻后沾取少量初級(jí)菌種，轉(zhuǎn)接至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，完成一級(jí)菌種的接種，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。6.4.2二級(jí)菌種接種一級(jí)菌種轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐時(shí)，三角瓶口和發(fā)酵罐接種口處需有火焰保護(hù)，保證無(wú)菌操作。同時(shí)發(fā)酵罐應(yīng)調(diào)節(jié)進(jìn)排氣閥，保持罐內(nèi)正壓。6.5發(fā)酵罐分批發(fā)酵參數(shù)發(fā)酵參數(shù)設(shè)置如下：a)發(fā)酵罐裝液量為60%～70%；b)發(fā)酵溫度為35℃~37℃;c)初始攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm～300rpm；d)接種量為裝液量的2%～5%；e)初始pH值7.2～7.5，發(fā)酵過(guò)程中pH值低于6.0時(shí)補(bǔ)加氨水（28%），維持pH值；f)發(fā)酵過(guò)程中向培養(yǎng)基中連續(xù)補(bǔ)充無(wú)菌空氣，通氣量為12.5L/min?？諝忭毥?jīng)0.2μm孔徑的疏水性空氣過(guò)濾器過(guò)濾除菌后使用；g)發(fā)酵周期為18h～36h，當(dāng)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)到3.0×109cfu/mL時(shí)結(jié)束發(fā)酵；h)發(fā)酵過(guò)程中可流加有機(jī)硅類消泡劑，也可在配置培養(yǎng)基時(shí)提前加入，具體根據(jù)設(shè)備性能決定。6.6規(guī)?；瘮U(kuò)大培養(yǎng)6.6.1菌種發(fā)酵用水預(yù)處理枯草芽孢桿菌發(fā)酵用水需提前經(jīng)過(guò)沉淀和砂濾，再用有效氯含量為8%～10%的次氯酸鈉消毒處理。每噸海水或淡水加入500mL～800mL次氯酸鈉溶液，處理24小時(shí)后以適量的硫代硫酸鈉中和并曝氣，利用淀粉碘化鉀溶液測(cè)試有無(wú)余氯。4DB21/T4043—20246.6.2菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)根據(jù)擴(kuò)培體積稱取發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入擴(kuò)培體積20%的發(fā)酵用水中，并向水中通入蒸汽?？刂扑囟仍?0℃~65℃,保持30min，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱溶解和消殺處理。趁熱將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入裝有擴(kuò)培體積80%發(fā)酵用水的發(fā)酵容器內(nèi)，待培養(yǎng)基混合均勻且溫度降至28℃~32℃時(shí)，快速將種子液倒入其中。接種后，取略大于桶口尺寸的全新透明塑料布蓋在桶口之上，四周用繩扎緊，塑料布中央穿孔，以便于通氣和排氣管通過(guò)。擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程，發(fā)酵參數(shù)設(shè)置如下：a)發(fā)酵容器裝液量為70%～80%；b)發(fā)酵溫度為28℃~32℃;c)接種量為裝液量的2%～3%；d)發(fā)酵周期72h～96h；e)發(fā)酵全程利用通氣管向培養(yǎng)基中連續(xù)補(bǔ)充過(guò)濾空氣。6.7發(fā)酵液處理發(fā)酵后菌液可直接使用或密封包裝至滅菌容器內(nèi)。7指標(biāo)檢測(cè)7.1抽檢檢測(cè)每批次產(chǎn)品隨機(jī)抽樣檢測(cè)，抽樣率不低于10%，檢測(cè)指標(biāo)包括感官、有效活菌數(shù)、雜菌率等，檢驗(yàn)合格后方可出廠使用。7.2感官檢測(cè)通過(guò)目測(cè)、鼻嗅方式對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)酵結(jié)束后菌液為黃色或黃褐色的懸濁液，有明顯發(fā)酵氣味，存放過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)沉淀。每批次產(chǎn)品會(huì)因培養(yǎng)基原料不同，在顏色和氣味上略有差異。7.3有效活菌數(shù)測(cè)定步驟如下：——將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用無(wú)菌的0.85%生理鹽水做10倍梯度連續(xù)稀釋?！x取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋倍數(shù)的菌液，用無(wú)菌移液管取100μL接種于固體培養(yǎng)基上，用滅菌后的玻璃珠或涂布棒均勻涂布于培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋樣品做3次重復(fù)。涂布好的平皿翻轉(zhuǎn)后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h?！囵B(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，可得到發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌的菌量。具體平板計(jì)數(shù)方法按GB/T26428執(zhí)行。7.4雜菌率測(cè)定從測(cè)定有效活菌數(shù)的稀釋樣品中，選取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋倍數(shù)的樣本，進(jìn)行枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中雜菌數(shù)量的測(cè)定。具體方法按GB20287執(zhí)行。8儲(chǔ)運(yùn)5DB21/T4043—2024檢驗(yàn)合格的產(chǎn)品應(yīng)儲(chǔ)存于通風(fēng)、干燥、清潔的倉(cāng)庫(kù)。倉(cāng)庫(kù)內(nèi)無(wú)有害氣體、易燃易爆危險(xiǎn)品及腐蝕性化學(xué)品，遠(yuǎn)離熱源。長(zhǎng)途運(yùn)輸時(shí)，防止日曬、雨淋，避免長(zhǎng)期受壓和機(jī)械損傷。產(chǎn)品應(yīng)盡快使用。6DB21/T4043—2024（資料性）發(fā)酵生產(chǎn)用培養(yǎng)基A.1種子培養(yǎng)