微生物蛋白提取和分離純化

微生物中蛋白的分離純化微生物蛋白提取和分離純化用途:藥物——多肽飼料——菌蛋白工業(yè)——酶

單細(xì)胞蛋白具有較門的營養(yǎng)價(jià)值。茵體中蛋白質(zhì)可達(dá)40、60％，其中氨基酸組份齊全，生物效價(jià)較高，相當(dāng)于酪蛋白，為70左右，而且賴氨酸等必需氨基酸含量較高，還具有豐富的維生素，可以作為維生案的補(bǔ)給品。按其所發(fā)揮的功能把小肽分為兩大類,即功能性小肽和營養(yǎng)性小肽。功能性小肽指能參與調(diào)節(jié)動物的某些生理活動或具有某些特殊作用的小肽,如抗菌肽、免疫肽、抗氧化肽、激素肽、表皮生長因子等。營養(yǎng)性小肽是指不具有特殊生理調(diào)節(jié)功能,只為蛋白質(zhì)合成提供氮架的小肽。目前，生物界已發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的酶有上百種。工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑，按用途不同可分為工業(yè)用酶和醫(yī)藥用酶兩大類，前者一般不需純制品，而后者要求的純度較高，其價(jià)格是前者的數(shù)千倍至數(shù)百萬倍。由微生物生產(chǎn)的工業(yè)用酶制劑主要有糖化酶、淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、半乳糖酶、纖維素酶、蛋白酶等，醫(yī)藥用酶主要有蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、尿激酶、鏈檄酶、天冬酰膠酶超氧化物歧化酶、溶菌酶、血溶栓酶等等微生物蛋白提取和分離純化蛋白質(zhì)的分離純化步驟(1)生物組織的機(jī)械破碎。(2)抽提：根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提:用離心法除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、膜分離法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法進(jìn)行精制。(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。微生物蛋白提取和分離純化根據(jù)所需的目的蛋白制定蛋白提取和純化的策略和步驟一般的預(yù)處理：過濾（工業(yè)生產(chǎn)）和離心（實(shí)驗(yàn)室研究）根據(jù)過濾機(jī)理的不同，過濾操作可分為澄清過濾（適合固體含量<0.1g/100ml、顆粒直徑5~100μm）和濾餅過濾（適合固體含量>0.1g/100ml）兩種。過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定的壓力差ΔP作用下，將懸浮液中的固體粒子截留，而與液體分離的技術(shù)。過濾設(shè)備：板框過濾機(jī)，真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)，錯(cuò)流過濾，硅藻土過濾機(jī)離心分離是利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動所產(chǎn)生的離心力，來實(shí)現(xiàn)懸浮液、乳濁液分離或濃縮的目的。根據(jù)離心原理，離心分離方法可分為：差速離心法,密度梯度離心法。差速離心法分別率不高，常用于常用于其他分離方法之前的粗制品提取和細(xì)胞器的分離。若要保持目的蛋白保持活性，則需要進(jìn)行低溫冷凍離心。微生物蛋白提取和分離純化預(yù)處理菌體表達(dá)的胞外酶上清（濾液）沉淀（濾餅）菌體表達(dá)的胞外酶分解培養(yǎng)基形成的小肽及一些氨基酸成分未分解利用的部分培養(yǎng)基菌體胞內(nèi)勻漿：胞內(nèi)表達(dá)的酶，小肽膜系結(jié)構(gòu)：周質(zhì)蛋白，膜蛋白微生物蛋白提取和分離純化細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)溶解微生物蛋白提取和分離純化機(jī)械法勻漿、研磨、壓榨、超聲等非機(jī)械法滲透、酶溶、凍融、化學(xué)等新方法激光破碎、冷凍噴射、相向流撞擊等微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化胞外酶取預(yù)處理后的上清液（濾液），根據(jù)目的蛋白的相關(guān)性質(zhì)，采用相關(guān)的方法提取純化目的蛋白。舉例：殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化微生物蛋白提取和分離純化粗酶液加入50%PEG6000至終濃度為5%4℃靜置2h4000rpm離心取上清，-20℃預(yù)凍15min加入等體積-20℃的丙酮混勻，-20℃靜置2h4000rpm離心取沉淀加入少量乙醚4℃真空干燥溶于醋酸緩沖液中10000rpm冷凍離心收集上清DEAE-SepharoseFF層析(（中等堿性）陰離子交換樹脂)CM一SephaorseFF層析（（弱酸性）陽離子交換樹脂）Supedrex一75層析（分子篩柱）SDS電泳透析后濃縮調(diào)節(jié)pH至5.6Sephaery1S一200HR層析酶活檢測微生物蛋白提取和分離純化層析過程（1）裝柱（2）平衡（equilibrium)（3）上樣(loading)（4）洗滌(washing)（5）洗脫(elution)（6）清洗與再生微生物蛋白提取和分離純化離子交換柱特點(diǎn)料液處理量大，在適宜的操作條件下，分離過程具有濃縮作用；分辨率較高：優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性；所需柱長較短可在較高流速下操作；吸附作用機(jī)理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)品回收率高；離子交換劑種類多，選樣余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。微生物蛋白提取和分離純化層析條件——離子強(qiáng)度、pH值、流速等。主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般來說，pH對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對于弱酸酸型離子交換劑在pH較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小；同時(shí)pH也影響樣品組分的帶電性。離子強(qiáng)度增大，交換容量則下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要通過降低交換容量把結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。微生物蛋白提取和分離純化離子交換柱層析的操作要點(diǎn)1.平衡緩沖液

2.上樣

3.洗脫緩沖液

4.洗脫速度

要保證各個(gè)待分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的穩(wěn)定；要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別；另外注意平衡緩沖液中不能含有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。離子交換層析上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量應(yīng)根據(jù)柱內(nèi)離子交換劑的交換容量決定，不宜過大，從而得到較好的分離效果。首先要保證在整個(gè)洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來。洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會造成分離時(shí)間長、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。微生物蛋白提取和分離純化洗脫按操作方式A.恒定洗脫(isocraticelution)B.分步洗脫(stageelution)C.梯度洗脫(gradientelution微生物蛋白提取和分離純化凝膠柱特點(diǎn)特點(diǎn)：（1）介質(zhì)不帶電荷,具有化學(xué)惰性，不與被分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，條件溫和，不會使物質(zhì)變性；（2）色譜介質(zhì)不需再生,可反復(fù)便用；（3）分離效率高，回收率較高；（4）廣泛應(yīng)用于生物大分子的初級分離，脫鹽等。（5）分辨率較低，需采用細(xì)長柱。（6）經(jīng)過凝膠過濾色譜后樣品被稀釋，上樣前需進(jìn)行濃縮微生物蛋白提取和分離純化Sephaery1S一200HR層析SephacrylHighResolution（即SephacrylHR）系列凝膠：是由烯丙基葡聚糖通過N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。凝膠的網(wǎng)孔特性由葡聚糖組分來控制，形成分級范圍不同的五種類型：S100~500HR，其中，數(shù)字越大，孔徑越大。微生物蛋白提取和分離純化特點(diǎn)：介質(zhì)的顆粒尺寸分布較窄，柱效高（9000塔板數(shù)/米）；在機(jī)械強(qiáng)度、理化特性、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)凝膠介質(zhì)由于其機(jī)械強(qiáng)度高，適合在高流速下進(jìn)行快速分離；可以用0.5mol/LNaOH作為清洗劑在pH7時(shí)能承受121℃、30min反復(fù)高溫滅菌而不會對層析效果產(chǎn)生明顯影響其分離效果不受去污劑、促溶鹽類、變性劑等影響能在多種有機(jī)溶劑存在下使用微生物蛋白提取和分離純化Supedrex-75層析柱

Superdex系列凝膠：是將葡聚糖與高交聯(lián)度的瓊脂糖顆粒共價(jià)結(jié)合而形成的。其中，瓊脂糖基質(zhì)決定了凝膠具有高度的理化穩(wěn)定性，而葡聚糖鏈決定了凝膠的層析特性。cross-linkedagarosedextrancross-sectionfromSuperdex?particle微生物蛋白提取和分離純化根據(jù)分級范圍不同，可分為若干型號。其中，數(shù)字越大，孔徑越大。prepgrade顆粒較大。SuperdexpeptideSuperdex30prepgradeSuperdex75、200（prepgrade）Superdex系列凝膠是目前分辨率和選擇性最高的凝膠介質(zhì)之一顆粒尺寸很小，大小分布均勻，填充成層析柱后柱效非常高（最高可達(dá)30000塔板數(shù)/米），即使在很高的流速下仍能獲得非常高的分辨率；在機(jī)械性能、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等方面均大大優(yōu)于傳統(tǒng)凝膠介質(zhì)。微生物蛋白提取和分離純化凝膠過濾層析的操作過程1.凝膠的選擇2.裝柱3.平衡（equilibrium)4.上樣(loading)5.洗脫(elution)6.凝膠再生和保養(yǎng)平衡緩沖液應(yīng)與洗脫緩沖液相同緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度和添加劑的選擇應(yīng)根據(jù)溶液與基質(zhì)的相互作用、可溶性和樣品的生化性質(zhì)、以及后續(xù)操作的要求等選擇。使用前通過0.45μm的膜過濾，可防止不溶性小顆粒堵塞柱子。平衡體積至少為5倍床體積。樣品集中上樣后，加洗脫液，防止返混洗脫液成份應(yīng)與膨脹膠和平衡時(shí)所用的液體相同微生物蛋白提取和分離純化層析結(jié)果見圖，分別收集峰，測定酶活，其中A峰活性最高，占上樣總活性的85.14%，因此收集峰A，進(jìn)行下一步層析。微生物蛋白提取和分離純化層析結(jié)果見圖，采用步進(jìn)式洗脫，收集各個(gè)峰，測定酶活力。其中峰b酶活最高，占上樣總活力的8.534%，因此收集峰b，濃縮后進(jìn)行下一步層析。微生物蛋白提取和分離純化發(fā)現(xiàn)峰A酶活最高，占總活活力的47.44%，通過SDS一PAGE檢測顯示為單帶。微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化析結(jié)果見圖，層析圖表明樣品僅有一個(gè)單峰，結(jié)合SDS結(jié)果，可以證明貴州綠僵菌AS3.4608所產(chǎn)殼聚糖酶是單亞基蛋白。微生物蛋白提取和分離純化在蛋白質(zhì)純化的起始階段，合適的粗分離手段能大大降低后續(xù)操作的難度。在傳統(tǒng)的粗分離方法中，實(shí)驗(yàn)室一般采用鹽析(如硫酸銨)分段沉淀，使用該法蛋白質(zhì)不易失活，但是操作體積較大，后處理麻煩，不能直接進(jìn)行離子交換層析，需要進(jìn)行脫鹽處理(如透析或小孔徑分子篩層析)，不適宜工業(yè)生產(chǎn)。工業(yè)上一般采用有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醇)沉淀，該法分辨率較高，沉淀速度快，能夠起到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的，且能夠降低鹽濃度。但是該法易使蛋白質(zhì)失活，樣品活力損失較大。微生物蛋白提取和分離純化目前還有一種粗沉淀蛋白質(zhì)的方法是采用如EPG等高分子物質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)，高分子溶液能夠維持蛋白質(zhì)構(gòu)像，使蛋白質(zhì)不易變性。但是一般使用高分子沉淀蛋白質(zhì)分辨率較低，不適合采用分級沉淀的方法來達(dá)到粗分離的目的，而且沉淀蛋白質(zhì)所需濃度的高分子溶液(如30%的PEG一6000)表觀粘度一般較大，給分離沉淀操作帶來不便。微生物蛋白提取和分離純化本研究向粗酶液中加入PEG6000至終濃度為5%，可以沉淀部分雜蛋白，由于PEG的絮凝作用，可以使難以除去的小穎粒都聚集在一起自然沉降下來，這一點(diǎn)通過加入PEG后粗酶液明顯分層且上清液很澄清即可看出:另一方面，PEG能夠在丙酮沉淀過程中保護(hù)蛋白質(zhì)，同時(shí)PEG能降低溶液的冰點(diǎn)，因而可以將蛋白質(zhì)溶液放入一20℃中預(yù)凍而不會結(jié)冰，在加入冷丙酮沉淀蛋白的過程中可以進(jìn)一步降低沉淀時(shí)的溫度，減小因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性帶來的活性損失。由于PEG溶于丙酮，大多數(shù)PEG通過離心隨上清液除去，余下留在沉淀中的少量EPG也可以通過離子交換層析除去。由于提取液中的鹽離子濃度較低，粗分離中也沒有引入高鹽濃度的溶液，因此沉淀蛋白質(zhì)溶解后可以直接進(jìn)行離子交換層析，而不需要脫鹽。微生物蛋白提取和分離純化如何選擇合適的層析條件，加快層析速度，簡化操作，增加收率一直是蛋白質(zhì)分離純化的重點(diǎn)和難點(diǎn)。采用陰離子交換樹脂，吸附目標(biāo)蛋白質(zhì)需要較高pH，而殼聚糖酶在高HP環(huán)境中不穩(wěn)定:而單獨(dú)采用陽離子交換樹脂雖然可以輕易將殼聚糖酶吸附，但是大量雜蛋白和色素隨之結(jié)合在層析柱上，采用KCl溶液洗脫時(shí)回不僅使大量難以脫去的色素隨目標(biāo)蛋白洗脫下來，給分子篩層析純化帶來困難，同時(shí)易產(chǎn)生層析柱的堵塞，降低層析速度。微生物蛋白提取和分離純化鑒于這種情況，本研究采用了陰、陽離子層析聯(lián)合使用的方法，先將樣品液通過陰離子交換樹脂，通過反吸附除去大量色素和酸性雜蛋白，而通過控制pH使目標(biāo)蛋白質(zhì)基本不與陰離子交換樹脂結(jié)合:隨后將穿透峰液體上樣陽離子交換樹脂，目標(biāo)蛋白能夠被陽離子柱吸附。通過陽離子樹脂的吸附，實(shí)際上可以起到將大體積的樣品液濃縮的作用，同時(shí)采用的步進(jìn)式洗脫方式，用KCl溶液洗脫下來都是己經(jīng)濃縮的酶液，可以減輕分子篩柱前對樣品高度濃縮的壓力。微生物蛋白提取和分離純化小肽來自于微生物胞內(nèi)或胞外的小肽大多為小肽混合液，小肽的分離建立在各種小肽不同分子量的基礎(chǔ)上，即初步的膜過濾后再進(jìn)行細(xì)化的凝膠過濾等分離手段進(jìn)行分離純化。微生物蛋白提取和分離純化將預(yù)處理后的上清液分別通過三種超濾膜進(jìn)行分離，分別獲得分子量>20000、20000～10000、10000～6000、<60004個(gè)肽段。根據(jù)所需的分子量范圍選擇相應(yīng)的凝膠柱進(jìn)行凝膠過濾層析，以分離目的小肽。超濾分離凝膠過濾SDS電泳確定所分離的小肽的分子量微生物蛋白提取和分離純化釀酒酵母胞內(nèi)無機(jī)焦磷酸酶的分離純化發(fā)酵液收集菌體蒸餾水洗滌三次pH7.5Tris-HCl緩沖液洗滌兩次離心取沉淀加Ph7.5-Tris-HCl緩沖液懸浮冰浴超聲波破碎10min10000r/min離心30min冰浴上清加(NH4)2SO4使其飽和度達(dá)到50%,放置6h,離心取上清上清液繼續(xù)加(NH4)2SO4使其飽和度為80%，放置過夜離心取沉淀用pH7.5Tris-HCl緩沖液溶解，得粗酶液DEAE-纖維素柱層析SDS電泳酶活檢測無機(jī)磷酸酶參與多種代謝途徑中的焦磷酸的水解作用，該酶在DNA和RNA聚合反應(yīng)、輔酶的合成、氨基酸和脂肪酸活化等反應(yīng)過程中都起著重要的作用。粗酶液先對水透析，再對50mmol/LTris-HCl透析。上DEAE-纖維素（DE-52）柱，上樣前先用50mmol/LTris-HCl平衡，上樣后，先用相同緩沖液洗脫兩個(gè)床體積，再用含NaCl10~0.3mol/L的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫微生物蛋白提取和分離純化微生物蛋白提取和分離純化空腸彎曲菌28KD~31KD外膜蛋白的初步

提取及鑒定

發(fā)酵液離心雙蒸水洗滌稱重每4g菌泥加入0·2mol/L、pH2·2甘氨酸-鹽酸緩沖液120ml4℃攪拌30min4℃,12000r/min離心15min取上清透析，濃縮SephadexG-75純化CJ28KD~31KD外膜蛋白SephadexG-75預(yù)處理,常規(guī)裝拄,藍(lán)色葡聚糖2000檢測裝拄效果,0·2mol/L、pH2·2甘氨酸-HCl緩沖液平衡30h,18滴/min,上樣CJ外膜蛋白,上樣量5ml/次,采用0·2mol/L、pH2·2甘氨酸-HCl緩沖液洗脫,4℃條件下,收集,分管比色,濃縮。空腸彎曲桿菌(CJ)是世界范圍內(nèi)最常見的胃腸道炎癥的致病菌之一。在發(fā)達(dá)國家CJ感染患病占腹瀉病人發(fā)病率均較高，我國CJ與沙門菌的檢出率占腹瀉病人病原菌的34·8%~57%。在迄今對CJ多種亞細(xì)胞抗原的研究中,認(rèn)為CJ外膜中28KD(PEB1),