分子生物學(xué)第五章原核轉(zhuǎn)錄

中心法則1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀(jì)后修正的“中心法則”轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一些概念轉(zhuǎn)錄:在RNA聚合酶的作用下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，將DNA攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程。其后果是合成一條魚DNA鏈序列完全相同（除T/U）的RNA單鏈。編碼鏈（codingstrand）:與mRNA序列相同的DNA鏈稱為編碼鏈，又叫有義鏈（sensestrand）。模板鏈（templatestrand）:根據(jù)堿基互補的原則指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈稱為模板鏈，又叫反義鏈（antisensestrand）。轉(zhuǎn)錄的基本特點1. 轉(zhuǎn)錄的不對稱性:在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。 模板鏈并非永遠在同一條單鏈上

轉(zhuǎn)錄的方向性:RNA聚合酶與DNA聚合酶聚合方向一樣是5-3方向，模板是3-5方向。轉(zhuǎn)錄有起始和終止位點: 轉(zhuǎn)錄單元:可被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成完整的RNA的一段DNA序列包括啟動子和終止子；一個轉(zhuǎn)錄單元可能包括多個基因(?)原材料:NTPsAtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.轉(zhuǎn)錄起點是指與新生RNA鏈第一個核苷酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基,通常為嘌呤。在原核中90%為嘌呤,A或G；把起點5’末端的序列稱為上游（upstream）,把其3’末端的序列稱為下游（downstream）。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的比較相同點:體現(xiàn)在酶學(xué)和化學(xué)上，反應(yīng)的方向，以DNA為模板，起始延伸終止三階段；不同點:不同點聚合酶；不同的底物；轉(zhuǎn)錄不需要引物，能夠起始新鏈的合成，而且保留5‘端3磷酸；產(chǎn)生的RNA不需要與DNA模板結(jié)合；正確率比復(fù)制低；轉(zhuǎn)錄對某個基因的重復(fù)的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生多個拷貝，復(fù)制1:1；終止方式RNA聚合酶RNA聚合酶是催化RNA合成的大分子:RNA聚合酶的反應(yīng)條件需雙鏈DNA模板;轉(zhuǎn)錄時，按5’3’方向合成RNA鏈；以4種NTP（A，U，G，C）為底物；不需引物，能夠起始新鏈的合成，而且保留5‘端3磷酸。2.2原核生物中的RNA聚合酶原核生物中由一種RNA聚合酶催化所有RNA(mRNA,rRNA和tRNA)的合成。核心酶:2，β；β’；ω亞基RNA聚合酶全酶σ亞基:啟動子的識別RNA聚合酶是目前已知的最大的酶之一。大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB1510001核心酶β和β‘共同形成RNA合成的活性中心，形成磷酸二酯鍵β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶與DNA模板結(jié)合σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子核心酶與DNA序列結(jié)合是隨機的,平均結(jié)合常數(shù)是2×1011；全酶因為包含σ亞基與特異序列（啟動子）的結(jié)合能力提高,降低與隨機序列結(jié)合的能力。核心酶與全酶的區(qū)別RNA聚合酶RNApolymerasescomeindifferentforms,butsharemanyfeaturesRNApolymerasesperformsessentiallythesamereactioninallcells1.識別啟動子,核心酶通過結(jié)合不同的σ因子能夠識別不同的啟動子2.結(jié)合DNA使之解鏈,并具有解旋和重新螺旋化DNA的作用3.RNA聚合作用4.識別轉(zhuǎn)錄終止信號5.與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速度6.在轉(zhuǎn)錄受阻時候進行自身調(diào)整,借助輔助因子回復(fù)和維持RNA的合成BacteriahaveonlyasingleRNApolymeraseswhileineukaryoticcellstherearethree:RNAPolI,IIandIII轉(zhuǎn)錄起始位點:新生RNA鏈第一個核苷酸對應(yīng)的DNA上堿基，+1轉(zhuǎn)錄的起始與轉(zhuǎn)錄的頻率:轉(zhuǎn)錄起始后RNA聚合酶通過啟動子的時間代表該啟動子的強弱，啟動子強，通過的時間短，轉(zhuǎn)錄頻率高；細菌RNApolymerase與轉(zhuǎn)錄相同的方向為下游，標(biāo)記為+1，+2，+3……，與轉(zhuǎn)錄相反的方向為上游，標(biāo)記為-1，-2，-3…；提純被保護的片段后卻發(fā)現(xiàn)，RNA聚合酶并不能重新結(jié)合或并不能選擇正確的起始點，表明在保護區(qū)外可能還存在與RNA聚合酶對啟動子的識別有關(guān)的序列。根據(jù)終止作用是否需要ρ因子（釋放因子，是實現(xiàn)終止作用的蛋白質(zhì)輔助因子），可以分為:轉(zhuǎn)錄單元:可被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成完整的RNA的一段DNA序列包括啟動子和終止子；細菌RNApolymerase依賴于ρ因子的終止子（弱終止子）依賴于ρ因子的終止子（弱終止子）模板鏈（templatestrand）:根據(jù)堿基互補的原則指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈稱為模板鏈，又叫反義鏈（antisensestrand）。1975年，Pribnow和Schaller將RNA聚合酶全酶與模板DNA結(jié)合后，用DNaseI降解DNA，得到41～44個核苷酸對的DNA片段。在原核中90%為嘌呤，A或G；“Crabclaw”shapeofRNAP

(TheshapeofDNApolis__)結(jié)合DNA使之解鏈，并具有解旋和重新螺旋化DNA的作用與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速度其后果是合成一條魚DNA鏈序列完全相同（除T/U）的RNA單鏈。結(jié)論:-10區(qū)有助于dsDNA解開，-35區(qū)有助于啟動子與DNA聚合酶全酶的結(jié)合（sigma因子介導(dǎo)）。Activecentercleft序列分析發(fā)現(xiàn)，在被保護區(qū)內(nèi)有一個由5個核苷酸組成的保守序列，是聚合酶結(jié)合位點，稱為Pribnow區(qū)，其中央大約位于起點上游10bp處，所以又稱為–10區(qū)。在某些細菌中含有識別不同啟動子的σ因子,以適應(yīng)不同生長發(fā)育階段的要求,控制不同基因轉(zhuǎn)錄的起始。RNApolymerases的亞基細菌RNApolymeraseThecoreenzymealonesynthesizesRNAaabb’waab’wRPB3RPB11RPB2RPB1RPB6相同的顏色代表兩個酶的同源區(qū)原核生物真核生物b“Crabclaw”shapeofRNAP

(TheshapeofDNApolis__)Activecentercleft啟動子的結(jié)構(gòu)和功能啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的保守的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點（+1）上游,因此不被轉(zhuǎn)錄。-10區(qū)的發(fā)現(xiàn)1975年,Pribnow和Schaller將RNA聚合酶全酶與模板DNA結(jié)合后,用DNaseI降解DNA,得到41～44個核苷酸對的DNA片段。序列分析發(fā)現(xiàn),在被保護區(qū)內(nèi)有一個由5個核苷酸組成的保守序列,是聚合酶結(jié)合位點,稱為Pribnow區(qū),其中央大約位于起點上游10bp處,所以又稱為–10區(qū)。其保守序列為TATAAT,位于-10bp左右,其中3′端的“T”十分保守。A.T較豐富,易于解鏈。它和轉(zhuǎn)錄起始位點I一般相距5bp。-35區(qū)的發(fā)現(xiàn)提純被保護的片段后卻發(fā)現(xiàn)，RNA聚合酶并不能重新結(jié)合或并不能選擇正確的起始點，表明在保護區(qū)外可能還存在與RNA聚合酶對啟動子的識別有關(guān)的序列。從噬菌體的左、右啟動子PL及PR和SV40啟動子的–35bp附近找到了另一段共同序列:TTGACA。與-10區(qū)序列相隔16-19bp。-10區(qū)和-35區(qū)在轉(zhuǎn)錄起始中的作用利用定點誘變技術(shù)突變啟動子，研究-10、-35區(qū)的功能。結(jié)果:-10區(qū)的突變不影響RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合速度，但是降低雙鏈DNA解鏈速度；-35區(qū)的突變降低RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合速度，但是不影響降低雙鏈DNA解鏈速度。結(jié)論:-10區(qū)有助于dsDNA解開，-35區(qū)有助于啟動子與DNA聚合酶全酶的結(jié)合（sigma因子介導(dǎo)）。－10區(qū)和－35區(qū)的最佳距離在原核生物中,－10區(qū)和－35區(qū)的最佳距離大約是16～19bp,17bp轉(zhuǎn)錄效率最高,約2個螺距,過大或過小都會降低轉(zhuǎn)錄活性。-10區(qū)和-35區(qū)之間的序列不重要,關(guān)鍵是距離。可能與RNAPol本身的大小和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。結(jié)構(gòu)典型,都含有識別（R）,結(jié)合（B）和起始（I）三個位點；序列保守,如-35序列,-10序列結(jié)構(gòu)都十分保守；位置和距離都比較恒定；直接和多聚酶相結(jié)合；常和操縱子相鄰；都在其結(jié)構(gòu)基因的5端；決定轉(zhuǎn)錄的啟動和方向。轉(zhuǎn)錄過程-起始（Initiation）轉(zhuǎn)錄起始:RNA聚合酶與dsDNA的結(jié)合啟動子:位于結(jié)構(gòu)基因5’-端上游區(qū)的DNA序列，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板準(zhǔn)確結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點:新生RNA鏈第一個核苷酸對應(yīng)的DNA上堿基，+1轉(zhuǎn)錄開始的部位記做+1,稱為轉(zhuǎn)錄起始點；與復(fù)制起始點（ori）不同,ori為一個區(qū)域,轉(zhuǎn)錄起始點為一個堿基；與轉(zhuǎn)錄相同的方向為下游,標(biāo)記為+1,+2,+3……,與轉(zhuǎn)錄相反的方向為上游,標(biāo)記為-1,-2,-3…；轉(zhuǎn)錄的位點沒有0。起始階段三步驟:1. 封閉二元復(fù)合物closedcomplex2. 開放二元復(fù)合物opencomplex3. 穩(wěn)定三元復(fù)合物StableternarycomplexRNA聚合酶含蓋在起始點的上游70bp處，這種結(jié)構(gòu)由DNA.RNA聚合酶構(gòu)成，叫做二元閉合復(fù)合體。當(dāng)DNA雙鏈變成單鏈時，稱為二元開放復(fù)合體，這個階段是不可逆的。解旋區(qū)域：－9---＋13。轉(zhuǎn)錄泡。聚合酶全酶的σ因子從復(fù)合物上釋放，合成9nt的RNA，由RNA聚合酶-DNA-新生RNA形成的復(fù)合物為三元復(fù)合物。此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄進入延伸階段。Transcriptionbubble三元復(fù)合物的去向流產(chǎn)式起始:合成并釋放2—9個核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物；形成轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物:盡快釋放亞基，而后盡快通過上游啟動子區(qū)，延伸RNA鏈至完成轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的起始與轉(zhuǎn)錄的頻率:轉(zhuǎn)錄起始后RNA聚合酶通過啟動子的時間代表該啟動子的強弱，啟動子強，通過的時間短，轉(zhuǎn)錄頻率高；反之轉(zhuǎn)錄頻率低。轉(zhuǎn)錄過程-延伸（Elongation）RNA聚合酶沿模板DNA移動,按照5’－3’方向合成RNA鏈的過程。RNA聚合酶覆蓋35--40bp區(qū)域,解旋區(qū)域大概是17bp,RNA合成時與DNA形成DNA－RNA雜合體,DNA重新螺旋之后,RNA被擠出DNA－RNA雜合體,僅在3‘端有20—30nt與酶或DNA結(jié)合。原核生物的RNA聚合酶（核心酶）按照5’－3’方向延伸RNA鏈,解旋區(qū)域也隨之移動,即邊解旋,邊合成,邊重新螺旋。轉(zhuǎn)錄過程-終止（Termination）RNA聚合酶延伸到終止位點時，轉(zhuǎn)錄結(jié)束，包括轉(zhuǎn)錄泡瓦解，RNA聚合酶和DNA.RNA分開等。終止子即轉(zhuǎn)錄終止位點，即提供終止信號的DNA序列。根據(jù)終止作用是否需要ρ因子（釋放因子，是實現(xiàn)終止作用的蛋白質(zhì)輔助因子），可以分為： 不依賴ρ因子的終止子（強終止子） 依賴于ρ因子的終止子（弱終止子）不依賴

因子的終止子終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū),RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在終止位點前面有一段由4-8個A組成的序列,RNA的3’端為寡聚U。發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。該類終止子也有回文區(qū)，但是不富含GC，回文結(jié)構(gòu)后無寡聚U序列，主要存在于噬菌體，細菌中少見；核心酶與DNA序列結(jié)合是隨機的，平均結(jié)合常數(shù)是2×1011；模板鏈（templatestrand）:根據(jù)堿基互補的原則指導(dǎo)RNA合成的DNA鏈稱為模板鏈，又叫反義鏈（antisensestrand）。RNA聚合酶覆蓋35--40bp區(qū)域，解旋區(qū)域大概是17bp，RNA合成時與DNA形成DNA－RNA雜合體，DNA重新螺旋之后，RNA被擠出DNA－RNA雜合體，僅在3‘端有20—30nt與酶或DNA結(jié)合。Transcriptionbubble與轉(zhuǎn)錄相同的方向為下游，標(biāo)記為+1，+2，+3……，與轉(zhuǎn)錄相反的方向為上游，標(biāo)記為-1，-2，-3…；轉(zhuǎn)錄的不對稱性:在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。產(chǎn)生的RNA不需要與DNA模板結(jié)合；opencomplex不需引物，能夠起始新鏈的合成，而且保留5‘端3磷酸。轉(zhuǎn)錄的起始與轉(zhuǎn)錄的頻率:轉(zhuǎn)錄起始后RNA聚合酶通過啟動子的時間代表該啟動子的強弱，啟動子強，通過的時間短，轉(zhuǎn)錄頻率高；把起點5’末端的序列稱為上游（upstream），把其3’末端的序列稱為下游（downstream）。流產(chǎn)式起始:合成并釋放2—9個核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物；在原核中90%為嘌呤，A或G；利用定點誘變技術(shù)突變啟動子，研究-10、-35區(qū)的功能。其后果是合成一條魚DNA鏈序列完全相同（除T/U）的RNA單鏈。破壞終止位點RNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)錄的不對稱性:在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。編碼鏈（codingstrand）:與mRNA序列相同的DNA鏈稱為編碼鏈，又叫有義鏈（sensestrand）。結(jié)合最弱的堿基配對A:U

解鏈更容易終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān),長度長效率高依賴于

因子的終止子因子:六聚體蛋白，具有NTP酶活和解螺旋酶活，能水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。各亞基具有ATPase結(jié)構(gòu)域和RNA結(jié)合域。RhofactorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingatarho-dependentterminator.Howdoesrhofactorwork?依賴于

因子的終止子作用機制該類終止子也有回文區(qū),但是不富含GC,回文結(jié)構(gòu)后無寡聚U序列,主要存在于噬菌體,細菌中少見；因子結(jié)合于轉(zhuǎn)錄物終止位點上游新生RNA鏈的5‘端的裝載位點,6個亞基組成六聚體；結(jié)合RNA之后激活A(yù)TPase活性,水解ATP推動因子六聚體沿RNA5-3方向靠近轉(zhuǎn)錄泡,速度比RNAPOL快；當(dāng)RNA聚合酶到達終止子區(qū)域,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),使RNApol暫停延伸,因子追上轉(zhuǎn)錄泡；終止子與因子共同作用使轉(zhuǎn)錄終止；因子的RNA-DNA解螺旋酶活性使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從DNA模板上釋放出來。抗終止阻止或影響終止子的形成或作用,使RNA聚合酶能夠順利通過該區(qū)域繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。