外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)

外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)當(dāng)前1頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

基因的體外重組和表達(dá)體系最早是利用大腸桿菌作為宿主，以后逐漸發(fā)展到真核生物細(xì)胞作為宿主，如酵母、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等。以植物細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化受體，不僅能把一些植物基因或DNA片段作為外源基因轉(zhuǎn)化到受體植物，而且能把動(dòng)物或微生物中存在的基因轉(zhuǎn)化并整合到植物基因組中，使其在植物細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)前2頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

外源基因在真核生物細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)于分子生物學(xué)理論研究，對(duì)真核生物基因表達(dá)調(diào)控的探討提供了其他試驗(yàn)方法難以達(dá)到的有力手段。外源基因如何才能轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞？又如何能從數(shù)量龐大的細(xì)胞群體中篩選出遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞？又是如何對(duì)轉(zhuǎn)化的真核生物進(jìn)行鑒定？當(dāng)前3頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。一、選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因：1.基因轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記

選擇標(biāo)記一般是一種基因，即選擇標(biāo)記基因，他在轉(zhuǎn)化前與待轉(zhuǎn)化外源基因相連接，當(dāng)把已轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體置于加有選擇劑的（抗生素）的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體或再生植株由于帶有選擇標(biāo)記基因，該基因的產(chǎn)物---酶能分解培養(yǎng)基中加入的選擇劑，因此，轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)選擇劑具有抵抗能力，不受選擇劑毒害而正常地生長(zhǎng)，發(fā)育。相反未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或再生植株受培養(yǎng)基中選擇劑的毒害，而不能存活下來(lái)而被淘汰。當(dāng)前4頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，neomycinphosphotransferaseⅡ,NptⅡ）NptⅡ基因表達(dá)產(chǎn)生的酶可催化許多氨基葡萄糖苷類(lèi)抗生素（如新霉素，慶大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化，使抗生素失去對(duì)細(xì)胞的毒性，這是由于磷酸化的抗生素不能與植物細(xì)胞葉綠體和線(xiàn)粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合，進(jìn)一步影響70S起始復(fù)合體合成，干擾線(xiàn)粒體和葉綠體的蛋白質(zhì)生物合成，使植物細(xì)胞最終死亡，因此，與外源基因結(jié)合的Npt基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，就可在含有抗生素的培養(yǎng)基上存活下來(lái)。當(dāng)前5頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（2）二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，Dhfr）

二氫葉酸還原酶為真核細(xì)胞核苷酸合成所必需，而氨甲喋呤（mathotrexate，MTX）作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抑制Dhfr酶的活性，當(dāng)培養(yǎng)基中存在MTX時(shí)，則由于植物細(xì)胞中不能合成四氫葉酸而抑制生長(zhǎng)。有一種Dhfr的突變酶，它與氨甲喋呤的親和力較正常酶降低260倍，突變酶不為MTX所抑制，抗MTX，將編碼該酶的基因與CaMV35S啟動(dòng)子拼接后導(dǎo)入植物細(xì)胞，則轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞能在含有MTX的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。相反，未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其Dhfr對(duì)培養(yǎng)基中的MTX十分敏感，而不能存活。當(dāng)前6頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（3）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hpt）潮霉素B作為一種抗生素對(duì)大多數(shù)植物均有毒性，但當(dāng)潮霉素B被細(xì)菌中分離到的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶催化而磷酸化時(shí)，其毒性喪失。利用這一特性，可以把hpt作為選擇標(biāo)記，即把htp基因和適合植物的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建成嵌合基因，轉(zhuǎn)化受體植物，轉(zhuǎn)化有htp基因的植物細(xì)胞能表達(dá)出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，使培養(yǎng)基中的潮霉素B磷酸化而失去毒性，反之，未轉(zhuǎn)化該基因的細(xì)胞則被潮霉素毒害致死。除了以上3種常用的選擇標(biāo)記基因之外，還有慶大霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因等抗生素類(lèi)選擇標(biāo)記，此后，又發(fā)展出非抗生素選擇標(biāo)記，如抗草甘膦類(lèi)除草劑基因等。當(dāng)前7頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。2.報(bào)告基因

報(bào)告基因是指用于檢測(cè)組裝的嵌合基因在導(dǎo)入細(xì)胞后是否具有功能的一種指示基因，它通常是編碼在離體條件下易于檢測(cè)的酶。具體是將報(bào)告基因連接在待研究的目的基因的啟動(dòng)子的下游，其后再連接真核生物的終止信號(hào)，然后將構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，不同器官和組織乃至細(xì)胞，分析其中的報(bào)告基因產(chǎn)物-酶活性，從而了解該目的基因在何時(shí)、何處表達(dá)。作為報(bào)告基因，其表達(dá)產(chǎn)物及產(chǎn)物的類(lèi)似功能在未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中原本并不存在。當(dāng)前8頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（1）β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidasegene，Gus）

Gus基因是編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的基因，最初為細(xì)菌中分離的uidA基因，后被應(yīng)用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，Gus基因的廣泛應(yīng)用，一方面是其測(cè)定方法簡(jiǎn)單、靈敏、植物內(nèi)源背景活性低。另一方面是由于它既可以通過(guò)熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，又可以進(jìn)行組織化學(xué)染色定位。熒光法測(cè)定β-葡糖醛酸糖苷酶的活性，一般用于測(cè)定Gus基因在原生質(zhì)體中的瞬間表達(dá)，或測(cè)定Gus基因在穩(wěn)定完整細(xì)胞中的表達(dá)。測(cè)定時(shí)以4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide）為底物，在Gus酶催化下，生成4-甲基傘形酮和β-D-葡萄糖醛酸。當(dāng)4-甲基傘形酮的羥基解離后可被365nm波長(zhǎng)的光激發(fā)，從而產(chǎn)生455nm熒光，在熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行定量分析。

當(dāng)前9頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

原位組織化學(xué)定位應(yīng)用于對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行Gus融合基因時(shí)空表達(dá)模式的精確分析，方法是用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β–葡糖醛酸，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronicacid）作為底物，把待檢測(cè)材料浸泡在含有底物的緩沖液中保溫，在組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體被Gus轉(zhuǎn)化的部位，Gus酶切割葡萄糖醛酸部分，產(chǎn)生無(wú)色的吲哚氧基中間產(chǎn)物，隨后經(jīng)氧化二聚作用形成5，5'-二溴-4，4'-二氯靛藍(lán)的藍(lán)色沉淀，經(jīng)顯微鏡鏡檢，觀察Gus活性部位，繼而了解嵌合基因表達(dá)的組織化學(xué)定位。該方法檢測(cè)要注意排除假陽(yáng)性存在的可能，有人對(duì)52中植物的內(nèi)源Gus活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段沒(méi)有內(nèi)源Gus活性，而在繁殖器官如胚、胚乳、果實(shí)種子、種皮中均有明顯的內(nèi)源活性，而隨著種子萌發(fā)又逐漸消失。當(dāng)前10頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。具體是將報(bào)告基因連接在待研究的目的基因的啟動(dòng)子的下游，其后再連接真核生物的終止信號(hào)，然后將構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。乙?；穆让顾夭辉賹?duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，故可作為選擇標(biāo)記。VirA以及VirG基因在酚類(lèi)物質(zhì)的誘導(dǎo)下得到表達(dá)。當(dāng)前56頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。Opinesfeedbacteriaacarbonandnitrogensource.植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是在1974年發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的基礎(chǔ)上形成的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，1983年獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。當(dāng)前27頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。把三種有關(guān)菌株混合培養(yǎng)在一起進(jìn)行的雜交稱(chēng)為三親雜交。當(dāng)前79頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（3）互補(bǔ)型載體：外源基因插入缺陷性病毒或置換某個(gè)基因。3、反義RNA及其在基因表達(dá)調(diào)控中的作用；當(dāng)前76頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。光誘導(dǎo)啟動(dòng)子，熱激蛋白啟動(dòng)子等。當(dāng)前62頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前74頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前11頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前12頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（2）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloroamphenicolacetyltransferase，Cat）Cat基因來(lái)自細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn9，它編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，以氯霉素為底物，使氯霉素乙?；群笊?-乙酰氯霉素、1-乙酰氯霉素和1.3-二乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，故可作為選擇標(biāo)記。乙酰化反應(yīng)產(chǎn)物采用薄層層析法分離，放射自顯影檢測(cè)各種乙?；a(chǎn)物在層析位置的放射強(qiáng)度。當(dāng)前13頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（3）熒光素酶基因（luciferasegene）

多取自螢火蟲(chóng)和細(xì)菌細(xì)胞。反應(yīng)底物為熒光素，在ATP和Mg2+存在下，酶促氧化脫羧，生成激活態(tài)氧化熒光素發(fā)射光子，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)弱可以通過(guò)熒光計(jì)測(cè)定，也可作X-光片直接檢測(cè)。

熒光素+ATP+O2氧化熒光素+AMP+PPi+CO2+光當(dāng)前14頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（4）綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因

gfp基因是從維多利亞水母中分離純化的一種可以發(fā)出綠色熒光的物質(zhì)。GFP為238個(gè)氨基酸的小蛋白，發(fā)色團(tuán)能吸收可見(jiàn)光而發(fā)射熒光，用熒光顯微鏡可檢測(cè)到GFP產(chǎn)生的綠色熒光。GFP檢測(cè)不需要添加任何底物或輔助因子，不使用同位素，不需要測(cè)定酶的活性等優(yōu)點(diǎn)，且在原核和真核生物中都能表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。當(dāng)前15頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前16頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。二、植物基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

植物基因轉(zhuǎn)移也稱(chēng)為遺傳轉(zhuǎn)化（genetictransformation），是指利用重組DNA技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移技術(shù)，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。

當(dāng)前17頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

當(dāng)前18頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。將外源基因成功轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，需要考慮3個(gè)方面：如何使外源基因進(jìn)入細(xì)胞？2.進(jìn)入植物細(xì)胞的基因是整合到基因組中，還是滯留在細(xì)胞之中？3.用于轉(zhuǎn)化的外植體是否能夠再生？當(dāng)前19頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是在1974年發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的基礎(chǔ)上形成的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，1983年獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1985年Horsch首創(chuàng)了葉盤(pán)法（leafdisctransformation），1987年，康乃爾大學(xué)研究者設(shè)計(jì)出基因槍?zhuān)?987年，Jefferson等人提出GUS（葡糖苷酸酶）基因融合系統(tǒng)，作為報(bào)告基因。當(dāng)前20頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前21頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

目前已發(fā)展出多種遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括物理方法、化學(xué)方法以及生物學(xué)方法。其中以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛，占約80％。轉(zhuǎn)化的目的基因包括各種抗病、抗蟲(chóng)、抗除草劑、延遲保鮮、改變花色花型、改良品質(zhì)以及疫苗等基因。當(dāng)前22頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前23頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前24頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前25頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前26頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前27頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

轉(zhuǎn)化方法可以劃分為直接基因轉(zhuǎn)移和間接基因轉(zhuǎn)移。（一）直接基因轉(zhuǎn)移：采用物理或化學(xué)的方法將外源目的基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并整合到染色體DNA上的技術(shù)。包括電激法、基因槍法、超聲波法、真空滲入法、PEG法、磷酸共沉淀法、微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。當(dāng)前28頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。1、電激法：利用高壓電脈沖把外源基因?qū)胫参锛?xì)胞實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的方法。

1985年由斯坦福大學(xué)FrommM等最先將CAT基因通過(guò)電激法導(dǎo)入胡蘿卜、煙草、玉米的原生質(zhì)體，測(cè)得瞬間表達(dá)。隨后康乃爾大學(xué)將外源基因?qū)朐|(zhì)體實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)化率隨質(zhì)粒DNA濃度、電脈沖強(qiáng)度以及持續(xù)時(shí)間增加而增加。當(dāng)前29頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前30頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。2、基因槍法（particlebombardment）：是利用高速微彈粒將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞或組織中的方法，也稱(chēng)為微彈射擊法、粒子轟擊法等。

最早由KleinTM在1987年創(chuàng)立，并將煙草花葉病毒RNA和CAT基因(Chloraphericolacetyltransferase氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞。系統(tǒng)將帶有包裹有目的基因的金屬顆粒（金?；蜴u粒），以很高的速度轟擊植物細(xì)胞，由于小顆粒穿透力強(qiáng)，故不需除去細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而進(jìn)入基因組，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的。

當(dāng)前31頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

基因槍由激發(fā)器、槍管、擋板和無(wú)菌小室等組成。將一定量的帶有目的基因的質(zhì)粒DNA，CaCl2、亞精胺與鎢粒一起離心或振蕩，可將目的基因吸附于鎢粒，通過(guò)基因槍把鎢粒以430米/秒的速度轟擊目標(biāo)，使目的基因穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入受體細(xì)胞?；驑屴D(zhuǎn)化既可以轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞，又可以轉(zhuǎn)化愈傷組織等。當(dāng)前32頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前33頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。通過(guò)抗生素殺死或抑制農(nóng)桿菌后進(jìn)行抗生素選擇。當(dāng)前32頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。另一方面是由于它既可以通過(guò)熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，又可以進(jìn)行組織化學(xué)染色定位。T-DNAcodesforproteinsthatproducehormonesandopines.當(dāng)前21頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。通過(guò)人工導(dǎo)入反義RNA，定向控制某些生物性狀的方法，成為反義技術(shù)。（5）T－DNA拷貝與植物基因組的整合。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)理：20世紀(jì)80年代，花椰菜花葉病毒(CaMV)雙鏈DNA基因組及其后RNA和單鏈DNA病毒基因組被用來(lái)構(gòu)建植物基因工程載體。報(bào)告基因

報(bào)告基因是指用于檢測(cè)組裝的嵌合基因在導(dǎo)入細(xì)胞后是否具有功能的一種指示基因，它通常是編碼在離體條件下易于檢測(cè)的酶。將外源基因成功轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，需要考慮3個(gè)方面：當(dāng)前39頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前25頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前36頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前83頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前34頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前35頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前36頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。3、超聲波法：

根據(jù)超聲波的空化作用，把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞。1990年許寧等把GUS基因通過(guò)該方法導(dǎo)入了小麥幼穗愈傷組織。當(dāng)前37頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。4、聚乙二醇法（PEG）：

PEG（polyethylene）具有細(xì)胞粘合作用和擾亂細(xì)胞膜的磷脂雙分子層的作用。1980年由Darey最早利用該方法將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體。1985年以后利用該方法將報(bào)告基因轉(zhuǎn)入種植物原生質(zhì)體，獲得瞬間表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。PEG法轉(zhuǎn)化率低，一般在10-5-10-6。當(dāng)前38頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。5、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：

利用磷酸堿或磷酸絲氨酸等脂質(zhì)構(gòu)成的雙層膜囊，可以包裹質(zhì)粒，DNA大分子、病毒顆粒等，通過(guò)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合將外源基因轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體細(xì)胞，或通過(guò)注射法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。6、真空滲入法：

利用真空作用使外源基因進(jìn)入植物體，細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)DNA的整合。當(dāng)前39頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。7、顯微注射法：

利用顯微裝置將質(zhì)粒DNA注射入宿主細(xì)胞的方法。利用極細(xì)(1μm)的玻璃毛細(xì)管裝入待轉(zhuǎn)移的外源DNA，然后在顯微鏡下直接將毛細(xì)管插入原生質(zhì)體等細(xì)胞，并注射DNA。當(dāng)前40頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（二）間接基因轉(zhuǎn)移：

某些病原生物（農(nóng)桿菌、病毒等）能夠通過(guò)感染宿主細(xì)胞，將病原生物DNA整合到宿主細(xì)胞基因組中，因此改造病原DNA，利用其侵染能力，能將外源基因?qū)胫参锘騽?dòng)物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。

以農(nóng)桿菌或病毒為載體的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程稱(chēng)為間接基因轉(zhuǎn)移。當(dāng)前41頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：（1）Ti質(zhì)粒：

革蘭氏陰性農(nóng)桿菌（AgrobacteriumTumefaciens）中存在的一種質(zhì)粒DNA。具有一段T－DNA能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入植物染色體DNA中并實(shí)現(xiàn)整合。當(dāng)前42頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前43頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前44頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前45頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

Ti質(zhì)粒約200Kb，一半序列參與質(zhì)粒復(fù)制、冠癭堿代謝和接合作用；對(duì)致瘤不起作用，另一半序列包括T－DNA區(qū)和毒性區(qū)（Virregion）。

T－DNA：章魚(yú)堿型農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T－DNA由兩部分組成，一部分與致瘤有關(guān)，稱(chēng)為左轉(zhuǎn)移DNA（TL－DNA），另一部分與致瘤無(wú)關(guān)，稱(chēng)為右轉(zhuǎn)移DNA（TR－DNA）。

TL－DNA含有編碼合成激素類(lèi)和冠癭堿類(lèi)的基因，由于激素基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，產(chǎn)生了過(guò)量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，破壞了內(nèi)源激素平衡，而導(dǎo)致植物細(xì)胞發(fā)生癌變。當(dāng)前46頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。Vir區(qū)：是T－DNA以外涉及誘發(fā)腫瘤的區(qū)域，在Ti質(zhì)粒的物理圖上位于T－DNA左側(cè)，長(zhǎng)30－40Kb，Vir區(qū)并不整合入植物基因，但卻是T－DNA轉(zhuǎn)移所必需。T－DNA邊界序列：T－DNA長(zhǎng)約23Kb，但在其兩端邊界各有一個(gè)25bp的正向重復(fù)序列，高度保守，一般認(rèn)為右端重復(fù)序列對(duì)T－DNA轉(zhuǎn)移起重要作用。當(dāng)前47頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的機(jī)理：（1）農(nóng)桿菌對(duì)植物傷口的附著；

植物傷口釋放出信號(hào)分子。如乙酰丁香酮（AS）以及羥基乙酰丁香酮（OHAS）等。當(dāng)前48頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（2）Vir區(qū)基因表達(dá)的誘導(dǎo)；

VirA以及VirG基因在酚類(lèi)物質(zhì)的誘導(dǎo)下得到表達(dá)。（3）T－DNA中間體和T－鏈蛋白復(fù)合體的形成；

VirD1和VirD2蛋白表達(dá)與T－DNA邊界重復(fù)序列結(jié)合解纏繞與切割，VirC1和VirC2參與下，形成T－DNA轉(zhuǎn)移中間體。并以DNA－蛋白質(zhì)復(fù)合體形式存在和轉(zhuǎn)移。VirE1和VirE2參與該過(guò)程。當(dāng)前49頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（4）T－鏈蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞；

T－鏈蛋白復(fù)合體（T－鏈、VirD2、VirE2）在VirB基因表達(dá)產(chǎn)物作用下，穿越細(xì)胞膜，VirB操縱子具有11個(gè)基因，產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜上并形成一種膜結(jié)合T－復(fù)合體運(yùn)輸器，其中VirD2和VirE2蛋白分別具有導(dǎo)航和核定位作用。VirD2、VirE2以及VirF蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞。（5）T－DNA拷貝與植物基因組的整合。

T－鏈蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞后，通過(guò)核膜上的小孔進(jìn)入細(xì)胞核，與核DNA整合。整合機(jī)制尚不清楚。當(dāng)前50頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前51頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。Agrobacteriaattachtoplantcellsurfacesatwoundsites.Theplantreleaseswoundsignalcompounds,suchasacetosyringone.ThesignalbindstovirAontheAgrobacteriummembrane.VirAwithsignalboundactivatesvirG.ActivatedvirGturnsonothervirgenes,includingvirDandE.virDcutsataspecificsiteintheTiplasmid(tumor-inducing),theleftborder.Theleftborderandasimilarsequence,therightborder,delineatetheT-DNA,theDNAthatwillbetransferredfromthebacteriumtotheplantcellSinglestrandedT-DNAisboundbyvirEproductastheDNAunwindsfromthevirDcutsite.Bindingandunwindingstopattherightborder.TheT-DNAistransferredtotheplantcell,whereitintegratesinnuclearDNA.T-DNAcodesforproteinsthatproducehormonesandopines.Hormonesencouragegrowthofthetransformedplanttissue.Opinesfeedbacteriaacarbonandnitrogensource.當(dāng)前52頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)：

組成重組質(zhì)粒，含有邊界序列，能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中穿梭；含有完整的Vir基因。（1）共整合載體系統(tǒng)：Ti質(zhì)粒上編碼致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代，帶有外源基因的pBR322衍生中間載體由大腸桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，發(fā)生同源重組，外源基因整合到Ti質(zhì)粒上。（2）二元載體系統(tǒng)：一個(gè)農(nóng)桿菌株系中含有兩個(gè)彼此分離的質(zhì)粒，一個(gè)含有T－DNA和外源重組基因的多功能克隆載體質(zhì)粒。既能在農(nóng)桿菌中復(fù)制，并能夠從大腸桿菌遷移到農(nóng)桿菌，另一個(gè)質(zhì)粒含有Vir基因的Ti衍生質(zhì)粒。當(dāng)前53頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前54頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前55頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。如何將以上構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌？1.直接用純化的小Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有vir區(qū)質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；2.采用三親雜交的方法。把三種有關(guān)菌株混合培養(yǎng)在一起進(jìn)行的雜交稱(chēng)為三親雜交。當(dāng)前56頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前57頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（2）Ri質(zhì)粒：

一種能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛發(fā)狀根的土壤桿菌（Agrobacteriumrhizogenes），具有Ri質(zhì)粒，能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入植物細(xì)胞中。其T－DNA包括TL－DNA和TR－DNA和中間大約15Kb的核心DNA，在TR－DNA上具有兩個(gè)非常重要的基因，tms1和tms2，指導(dǎo)IAA合成，TR－DNA上還有編碼農(nóng)桿堿合成和甘露堿合成的基因。當(dāng)前58頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。2、病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移：當(dāng)前59頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

病毒侵染細(xì)胞后把DNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞，這些病毒能在寄主細(xì)胞借助寄主的遺傳系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，該過(guò)程與農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒類(lèi)似，也是一種潛在的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。病毒作為基因轉(zhuǎn)化載體，已應(yīng)用與微生物和動(dòng)物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，然而在植物基因轉(zhuǎn)移研究中仍處于初級(jí)階段。主要原因是大多數(shù)植物病毒是以RNA為遺傳物質(zhì)，對(duì)于RNA操作并沒(méi)有DNA不成熟。因此載體構(gòu)建較困難。此外，未發(fā)現(xiàn)像動(dòng)物細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄病毒那樣能夠整合到宿主基因組中的植物病毒。因此，外源基因只能以游離拷貝的形式存在與細(xì)胞中，不能整合到植物染色體上進(jìn)行穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。20世紀(jì)80年代，花椰菜花葉病毒(CaMV)雙鏈DNA基因組及其后RNA和單鏈DNA病毒基因組被用來(lái)構(gòu)建植物基因工程載體。

當(dāng)前60頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。植物病毒載體系統(tǒng)（1）單鏈RNA植物病毒載體系統(tǒng)單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA克隆到質(zhì)粒上，把外源基因插入病毒的cDNA，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄，帶有外源基因的病毒DNA感染進(jìn)入植物宿主細(xì)胞。（2）單鏈DNA植物表達(dá)載體系統(tǒng)由單鏈DNA分子組成，存在成對(duì)的病毒顆粒，即雙生病毒，可以把外源基因插入其中一種DNA。（3）雙鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng)將病毒基因組中非必需的核苷酸序列去掉，換上一段外源DNA而不影響病毒基因組的包裝，用這種病毒載體感染植物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。如花椰菜花葉病毒（CaMV），番茄金花葉病毒（TGMV）。當(dāng)前61頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。

病毒表達(dá)載體構(gòu)建策略當(dāng)前62頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。植物病毒表達(dá)載體：（1）置換型載體：外源基因置換植物病毒基因組復(fù)制影響不大的基因（2）插入型載體：外源基因插入病毒基因組不重要的編碼區(qū)（3）互補(bǔ)型載體：外源基因插入缺陷性病毒或置換某個(gè)基因。（4）表位展示型載體：通過(guò)在外殼蛋白基因中選擇性地插入外源基因，在不影響病毒組裝，侵染和復(fù)制的前提下，使其在病毒顆粒表面呈現(xiàn)，成為抗原決定簇（外源蛋白）植物病毒表達(dá)載體應(yīng)用存在的問(wèn)題：（1）外源基因在轉(zhuǎn)化植物中的穩(wěn)定性差：不能整合（2）病毒的致病性；誘發(fā)病毒病癥狀（3）植物病毒載體攜帶的外源基因和病毒載體本身的不穩(wěn)定。外源基因易丟失，病毒基因組易突變。當(dāng)前63頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（三）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化基本程序：

1.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、純化保存及工程菌液的制備；28℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期2.外植體的選擇；幼嫩葉片、子葉、下胚軸等3.外植體預(yù)培養(yǎng)、接種；4.農(nóng)桿菌侵染；OD600為0.5-0.75.農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)；

共培養(yǎng)時(shí)間在16h以上，1-3d，農(nóng)桿菌增殖適度，加入AS等酚類(lèi)物質(zhì)。6.外植體脫菌及選擇培養(yǎng)。通過(guò)抗生素殺死或抑制農(nóng)桿菌后進(jìn)行抗生素選擇。

當(dāng)前64頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。葉圓片法：

利用打孔器取得葉圓片或用刀切割葉片小塊，造成傷口，然后在傷口處侵入農(nóng)桿菌，去除多余菌液，置于適合的培養(yǎng)基表面培養(yǎng)一段時(shí)間（2-3d），再轉(zhuǎn)移至含有抗生素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇并殺菌，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞逐漸形成愈傷組織，再分化出不定芽，進(jìn)一步形成完整轉(zhuǎn)化植株。（1）植物材料與農(nóng)桿菌的培養(yǎng)；（2）共培養(yǎng)；（3）篩選轉(zhuǎn)化植株；抗生素篩選（4）轉(zhuǎn)化植株的分子雜交鑒定；PCR擴(kuò)增，South雜交，North雜交，Western雜交，酶活性分析等。（5）性狀鑒定：抗逆性，生長(zhǎng)發(fā)育特征整株感染活體接種或受傷部位侵染，然后切下培養(yǎng)和篩選。原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)處于再生壁階段的原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)36-48h，離心洗滌后培養(yǎng)在含抗生素的培養(yǎng)基上篩選。當(dāng)前65頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前66頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。番茄遺傳轉(zhuǎn)化操作過(guò)程當(dāng)前67頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。番茄遺傳轉(zhuǎn)化操作過(guò)程當(dāng)前68頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（4）生物芯片技術(shù)檢測(cè)：將不同被檢樣品的mRNA分別用不同熒光物質(zhì)標(biāo)記，各種探針等量混合與同一陣列雜交，分析雜交信號(hào)，即可明確外源基因表達(dá)強(qiáng)弱差異。T-DNAcodesforproteinsthatproducehormonesandopines.當(dāng)前69頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前58頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。（2）二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，Dhfr）外源基因在當(dāng)代可以檢測(cè)到，還需要再下一代，甚至幾代能夠檢測(cè)到，才具有遺傳穩(wěn)定性。當(dāng)前6頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前7頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。最早由KleinTM在1987年創(chuàng)立，并將煙草花葉病毒RNA和CAT基因(Chloraphericolacetyltransferase氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞。外源基因在真核生物細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)于分子生物學(xué)理論研究，對(duì)真核生物基因表達(dá)調(diào)控的探討提供了其他試驗(yàn)方法難以達(dá)到的有力手段。當(dāng)前75頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。利用這一特性，可以把hpt作為選擇標(biāo)記，即把htp基因和適合植物的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建成嵌合基因，轉(zhuǎn)化受體植物，轉(zhuǎn)化有htp基因的植物細(xì)胞能表達(dá)出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，使培養(yǎng)基中的潮霉素B磷酸化而失去毒性，反之，未轉(zhuǎn)化該基因的細(xì)胞則被潮霉素毒害致死。（1）生理生化指標(biāo)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)性狀；（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，neomycinphosphotransferaseⅡ,NptⅡ）外源基因在真核生物細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)于分子生物學(xué)理論研究，對(duì)真核生物基因表達(dá)調(diào)控的探討提供了其他試驗(yàn)方法難以達(dá)到的有力手段。當(dāng)前69頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前70頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前71頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前72頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前73頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前74頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。當(dāng)前75頁(yè)，共84頁(yè)，星期日。三、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定分子檢測(cè)（1）Southern雜交，PCR檢測(cè)：在DNA水平進(jìn)行檢測(cè)（2）Northern雜交與RT-PCR檢測(cè)：RNA水平進(jìn)行檢測(cè)，還可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtimequantitativefluorescentPCR）