白骨壤鹽脅迫響應(yīng)基因AmSK32的克隆及異源轉(zhuǎn)化擬南芥

前言1.1研究背景土壤鹽漬化問題確實(shí)是一個(gè)全球性的挑戰(zhàn)，特別是在中國(guó)，它給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生態(tài)環(huán)境帶來了深遠(yuǎn)的沖擊。由于人類行為的增多，鹽漬化的土地范圍正在逐漸增長(zhǎng)，這已經(jīng)給我們的糧食供應(yīng)以及生態(tài)系統(tǒng)帶來了極其嚴(yán)峻的考驗(yàn)REF_Ref14545\r\h[1]。傳統(tǒng)育種方法雖然在一定程度上能夠解決一些問題，但存在耗時(shí)、成本高等缺點(diǎn)。相比之下，分子育種方法具有針對(duì)性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，因此備受研究者青睞REF_Ref15865\r\h[2]。紅樹林這一森林生態(tài)系統(tǒng)主要分布在熱帶與亞熱帶的濱海濕地區(qū)域，由生長(zhǎng)在高潮線附近的木本植被構(gòu)成，這些植物大多是四季常青的喬灌木類REF_Ref15940\r\h[3]。這些植物群落在凈化海洋生態(tài)、抵御風(fēng)浪侵蝕、吸收并固定大氣中的二氧化碳、保護(hù)生物多樣性等環(huán)境層面具有極其重要的功能，因此被譽(yù)為“濱海生態(tài)屏障”與“藍(lán)色地球之肺”。除此之外，紅樹林亦是多種稀有且瀕臨滅絕水生鳥類的重要棲息之所，并為各類魚類和甲殼類海洋生物提供了繁衍與發(fā)展的適合環(huán)境REF_Ref16041\r\h[4]。白骨壤（Avicenniamarina），學(xué)名海欖雌，白骨壤的特點(diǎn)就是它的根系特別發(fā)達(dá)，淺層的根系寬度比樹冠還要寬，最長(zhǎng)的地方甚至能長(zhǎng)到8米以上。這樣的根系結(jié)構(gòu)讓白骨壤能夠吸收到更多的土壤養(yǎng)分。而且，它還有像手指一樣的氣生根，在貧瘠的沙灘環(huán)境中具有顯著的適應(yīng)性。因此，白骨壤被大家稱為紅樹林里的先鋒樹種REF_Ref16080\r\h[5]。白骨壤亦屬于具備排鹽能力的紅樹植物，堪稱對(duì)鹽分的耐受度最高之物種。其通過葉及莖部表層細(xì)胞形成的鹽腺結(jié)構(gòu)排出體內(nèi)過量鹽分，確保體內(nèi)鹽濃度保持在較低水平，以此方式減少鹽分對(duì)其生長(zhǎng)的不良影響REF_Ref16126\r\h[6]。植物對(duì)鹽分的適應(yīng)性由多種因素構(gòu)成，這些因素包括生物形態(tài)、電解質(zhì)均衡、滲透壓調(diào)控以及抗氧化機(jī)能等。生物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能是相適應(yīng)的。以紅樹植物為例，在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，紅樹植物的根、莖、葉等器官的進(jìn)化越來越適應(yīng)高鹽度的環(huán)境。葉片肉質(zhì)化可以儲(chǔ)存更多的水分從而稀釋鹽分保護(hù)植物REF_Ref16175\r\h[7]；葉片的表皮毛可以減少蒸騰，泌鹽性植物具有鹽腺可以將多余的鹽分轉(zhuǎn)移到鹽腺的收集細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞排出體外，使體內(nèi)鹽度達(dá)到平衡范圍REF_Ref16224\r\h[8]。根部能為植物充分吸收土壤里的水分，其根部細(xì)胞富含三萜醇，具有拒鹽作用，可以減少木質(zhì)部鹽分含量REF_Ref16266\r\h[9]。此外，根系內(nèi)皮層的凱氏帶也助于減少鹽分吸收和運(yùn)輸，共同保護(hù)紅樹植物免受鹽分傷害REF_Ref16315\r\h[10]。植物對(duì)鹽分的抵抗能力取決于其離子穩(wěn)態(tài)的精細(xì)調(diào)控，尤其是通過精確管理細(xì)胞內(nèi)部的Na+、K+、H+等離子濃度REF_Ref16364\r\h[11]。例如，白骨壤和梧桐樹等植物通過高效的機(jī)制維持這種微妙的平衡。值得注意的是，鹽腺細(xì)胞的排鹽過程是一個(gè)能量密集型活動(dòng)，它依賴于ATP的生成，而這個(gè)過程主要由H+質(zhì)子泵驅(qū)動(dòng)，它不僅有助于排出過量的Na+REF_Ref16407\r\h[12]，還防止了細(xì)胞質(zhì)中Na+濃度過高引發(fā)的代謝混亂REF_Ref16456\r\h[13]。同樣，鉀離子在維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡中扮演著核心角色。在面臨NaCl壓力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鈉離子水平顯著上升，與此同時(shí)鉀離子含量也隨之顯著增加，這種策略有效地防止了離子失衡引發(fā)的潛在損害。因此，鉀離子的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)在抵御鹽害中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用REF_Ref16505\r\h[14]。滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)高鹽環(huán)境的重要手段，植物通過合成和積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿等，以維持細(xì)胞的滲透壓平衡REF_Ref16554\r\h[15]。此外，抗氧化系統(tǒng)也在植物耐鹽過程中發(fā)揮著重要作用，植物還可以通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性，清除活性氧自由基，減輕鹽脅迫對(duì)細(xì)胞的損傷REF_Ref16593\r\h[16]。先前的探索揭示了植物GSK3蛋白激酶可能在處理非生物壓力方面扮演重要角色。經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)，在鹽脅迫條件下，AtSK家族的三個(gè)成員（AtSK13、AtSK31和AtSK42）的基因表達(dá)量有所增強(qiáng)。多數(shù)擬南芥GSK3基因在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)，諸如NaCl、PEG之類的逆境刺激REF_Ref16645\r\h[17]，而BIL2不僅在轉(zhuǎn)錄層面上受到NaCl的影響，還受到與逆境緊密相關(guān)的植物激素脫落酸的誘導(dǎo)REF_Ref16701\r\h[18]。有趣的是，過表達(dá)BIL2的轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于對(duì)照組顯示出更高的鹽脅迫耐受性REF_Ref16737\r\h[19]。而AtSK22/BIL2的異源表達(dá)挽救了鹽脅迫敏感酵母突變體REF_Ref16779\r\h[20]。過表達(dá)AtSK22/BIL2的轉(zhuǎn)基因擬南芥中鹽脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)增加，從而增強(qiáng)其對(duì)鹽脅迫的抗性REF_Ref16821\r\h[21]。AtSK11在非生物脅迫反應(yīng)中的功能正逐漸被闡明。研究表明，AtSK11通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）的磷酸化來增強(qiáng)擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受能力。在高鹽脅迫條件下，AtSK11的激酶活性增加，而AtSK11基因的敲除則導(dǎo)致植物對(duì)鹽脅迫的敏感性增加REF_Ref16883\r\h[22]。進(jìn)一步的研究表明，高鹽誘導(dǎo)了G6PD的活性，并且在AtSK11敲除突變體中，這種活性增加更為顯著，而在過表達(dá)AtSK11的突變體中則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。通過質(zhì)譜分析和突變體研究的組合分析，確定了G6PD6的Thr467殘基是AtSK11介導(dǎo)的磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，將G6PD6的Thr467殘基突變?yōu)門467A會(huì)降低AtSK11介導(dǎo)的活性，而模擬磷酸化的T467E突變則會(huì)增強(qiáng)G6PD6的催化活性，這表明AtSK11通過磷酸化G6PD6的Thr467殘基來激活G6PD6，從而增強(qiáng)擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受能力REF_Ref16883\r\h[22]。圖1-1白骨壤葉片和根中AmSKs基因在不同鹽處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況GSK3廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫等過程，但其在白骨壤中的研究很大程度上仍然是未知的。我們前期研究發(fā)現(xiàn)（圖1-1），在鹽脅迫處理?xiàng)l件下，AmSK32在白骨壤的葉片和根組織中均被誘導(dǎo)表達(dá)，暗示該基因可能在白骨壤鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮功能。為了深入了解其功能，本研究通過對(duì)AmSK32基因進(jìn)行克隆并遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，通過篩選獲得陽(yáng)性過表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系（AmSK32-OE），為深入探究AmSK32基因的鹽脅迫響應(yīng)功能和調(diào)控機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)，為我國(guó)抗逆育種工程提供基因資源。1.2技術(shù)路線2材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)材料白骨壤幼苗購(gòu)自于海南東寨港，種植于富含營(yíng)養(yǎng)的土壤中，該土壤由營(yíng)養(yǎng)土：蛭石3：1的比例混合而成。在室內(nèi)的培養(yǎng)環(huán)境中，設(shè)置溫度為22℃，并進(jìn)行每日16小時(shí)的光照與8小時(shí)的黑暗循環(huán)，經(jīng)過一個(gè)月的適應(yīng)性培養(yǎng)后，進(jìn)一步對(duì)植株進(jìn)行了鹽分脅迫的實(shí)驗(yàn)研究。2.2實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備表2-1實(shí)驗(yàn)器材及廠商名稱來源恒溫?fù)u床高壓滅菌鍋數(shù)顯恒溫水浴鍋高速冷凍離心機(jī)電熱鼓風(fēng)干燥箱超凈工作臺(tái)上海知楚儀器有限公司ZEALWAY上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠海南光威科技有限公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司蘇潔凈化2.3培養(yǎng)基的配置表2-2LB固體培養(yǎng)基的配制配方用量/L胰蛋白胨酵母浸粉氯化鈉瓊脂蒸餾水10.0g5.0g5.0g10.0g補(bǔ)足至1000mL注：配制LB液體培養(yǎng)基時(shí)不加入瓊脂表2-3MS培養(yǎng)基的配制配方用量/L蔗糖瓊脂粉MS蒸餾水30.0g8.0g47.0g補(bǔ)足至1000mL表2-4蔗糖懸浮液配制配方用量/L蔗糖Silwetl-77AS蒸餾水50.0g0.5mL1.0mL補(bǔ)足至1000mL2.4實(shí)驗(yàn)方法2.4.1白骨壤總RNA的提取使用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，中國(guó)）在冰上對(duì)白骨壤提RNA。1.在液氮冷凍條件下，選取50-100mg的植物組織器官（葉片、果實(shí)果肉、根部、花），迅速研磨成粉。2.將粉末與500μL裂解液SL（475μL裂解液，25μLβ-硫基乙醇）混合，12000rpm，2min。3.上清液轉(zhuǎn)移至CS過濾柱，12000rpm，2min，吸取上清液。4.在吸附柱CR3中加入0.4倍上清液體積的無水乙醇。12000rpm，15s，棄廢液。5.將350μL去蛋白液RW1加入CR3中，12000rpm，15s，棄廢液。6.DNaseⅠ工作液制備比例為，DNaseⅠ儲(chǔ)存液：RDD緩沖液為1：7。7.向CR3中加入80μLDNaseⅠ靜置15min。再加入350μLRW1，12000rpm，15s，棄廢液后放回收集管。8.加入500μL漂洗液RW至CR3，12000rpm，15s，棄廢液再放回收集管。9.重復(fù)步驟810.12000rpm，2min。將CR3放入新的RNase-Free離心管中，滴加30-50μLRNase-FreeddH2O至吸附膜，靜置2min。12000rpm，1min，得到RNA溶液。2.4.2cDNA的獲取以RNA為模板用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix試劑盒（全式金，北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。遵循操作手冊(cè)的具體步驟，所有步驟均在冰上進(jìn)行，操作步驟如表2-5。1.加入表2-5cDNA反應(yīng)體系組分用量TotalRNA/mRNAAnchoredOligo(dT)18primer(0.5μg/μL)2×TSReactionMixTransScriptRT/RIEnzymeMixgDNARemoverRNase-freeWater5μL1μL10μL1μL1μL補(bǔ)足至20μL2.輕輕混勻，42℃孵育30分鐘。3.85℃加熱5秒鐘失活TransScriptRT/RI與gDNARemover。2.4.3瓊脂糖凝膠電泳1.依據(jù)所需要的瓊脂糖濃度以及溶液的總量，準(zhǔn)確秤出所需量的瓊脂糖并加入到錐形瓶里。2.取適量的TAE緩沖溶液倒入之前放有瓊脂糖的錐形瓶里，注意動(dòng)作要輕柔以防瓊脂糖形成顆粒。3.把裝有混合物的錐形瓶放進(jìn)微波爐，加熱至瓊脂糖完全融解，溶液變得清亮沒有粘稠感。4.冷水沖洗降溫至不燙手即可。5.使用移液槍加入溴化乙錠（核酸染料）并迅速搖晃使其充分混勻。6.將膠倒入已插好齒梳的制膠模具中，（從一個(gè)角勻速倒入，且倒膠時(shí)溫度不可太低，否則凝膠不均勻）7.靜置15min，等待膠完全凝固，垂直拔出齒梳。8.取出瓊脂糖凝膠刮去底部邊緣多余的膠后放入電泳槽中，放穩(wěn)后使TAE注滿樣品槽。9.在電泳槽中加入TAE至液面恰好沒過膠面上表面。2.4.4大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)1.接菌劃線法：將接種環(huán)蘸取菌液后，在培養(yǎng)皿中劃線，線要首尾相連，注意接種環(huán)不能頻入培養(yǎng)基內(nèi)獲得單菌落。2.挑菌（1）每個(gè)LB固體培養(yǎng)基用槍頭挑5個(gè)大的單菌落進(jìn)已裝有10μL無菌水的200μL離心管中，作標(biāo)記。（2）挑完菌后在離心管中用移液槍吹打混勻，進(jìn)行培養(yǎng)。2.4.5大腸桿菌的轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化操作步驟如下。（大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自普因特生物工程有限公司）1.將感受態(tài)細(xì)胞在-80℃環(huán)境中取出，并迅速將其置于碎冰上，經(jīng)5min左右待細(xì)菌逐漸解凍之際，加入目的DNA，手動(dòng)搖晃EP管底部來輕和混合，靜置30min于冰上。2.將EP管浸入42℃水浴鍋中進(jìn)行熱擊1min，期間不得搖晃EP管。3.熱擊完成后，立刻將EP管轉(zhuǎn)移到冰上冷卻，靜置約5min，期間不得晃動(dòng)。4.事先準(zhǔn)備無菌的LB液體培養(yǎng)基，然后利用移液槍把800μL的LB培養(yǎng)基注入管中，接著放入設(shè)定為37℃、200rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1h。5.在常溫下以每分鐘6000rpm離心5min以沉降微生物，隨后保留大約150μL的上清液。利用移液器輕柔地吸吹打重懸菌體，并吸取出一定量的細(xì)菌溶液施加于已準(zhǔn)備好含有抗性Kana的LB平板上。用無菌的涂布棒勻布細(xì)菌，再將培養(yǎng)皿用封口膜封好，放置在37℃的恒溫箱中倒置培養(yǎng)12至16小時(shí)。2.4.6大腸桿菌質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)使用試劑盒為TIANprepMiniPlasnidKit（天根，中國(guó)），使用前將無水乙醇加入漂洗液PW中。1.向吸附柱CP3加入500μL平衡緩沖液BL，12000rpm離心1min，棄廢液，放回收集管。2.取3mL待提取質(zhì)粒菌液放入離心管，12000rpm離心1min，棄上清液后加入250μLP1溶液，進(jìn)行吹打混勻。加入250μLP2溶液，上下翻轉(zhuǎn)幾次。再加入350μLP3溶液，上下翻轉(zhuǎn)幾次，2000rpm離心10min。3.將上清液轉(zhuǎn)移至CP3，12000rpm離心1min，棄廢液，放回收集管。4.向CP3注入500μL去蛋白液PD，12000rpm離心1min，棄廢液，放回收集管。5.加600μLPW至CP3，12000rpm離心1min，棄廢液，放回收集管。6.重復(fù)操作步驟57.12000rpm離心2min，徹底去除CP3中PW。8.將CP3放入新的離心管中，滴加60μLEB洗脫緩沖液至吸附膜核心區(qū)域，靜置2min，12000rpm離心2min，獲得含有質(zhì)粒溶液的離心管。2.4.7農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自莊盟生物，轉(zhuǎn)化操作步驟如下。1.將農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，置于冰上待其融化。2.將1μg質(zhì)粒緩慢加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔混勻。3.將混合物置于冰上，靜置5min，讓細(xì)胞充分吸收質(zhì)粒。4.準(zhǔn)備好液態(tài)氮，將裝有混合物的離心管迅速浸入液態(tài)氮中，讓混合物在液態(tài)氮中進(jìn)行5min的冷凍。5.37℃水浴5min。6.將500μL的無抗性液態(tài)LB培養(yǎng)基加入進(jìn)離心管中，放入28℃、200rpm的搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間控制在3至6小時(shí)，使菌體得到恢復(fù)。7.在常溫條件下以8000rpm速度進(jìn)行離心操作3min，分離細(xì)菌，并保留大約150μL的上清液部分。之后使用移液器輕輕吹洗以重新懸浮細(xì)菌，利用無菌的涂布棒在已準(zhǔn)備好含有Kana和Rif抗生素的LB平板上均勻涂布。隨后以封口膜密封平板，在無光線的條件下，將平板倒置并放置在28℃的環(huán)境中培養(yǎng)2至3天。2.4.8擬南芥的種植1.培育擬南芥的培養(yǎng)土采用的是營(yíng)養(yǎng)土：蛭石依照3：1的體積比混合而成。當(dāng)擬南芥幼苗在培養(yǎng)皿里萌發(fā)并長(zhǎng)出2至4片真葉，便可將其轉(zhuǎn)植入泥土。轉(zhuǎn)移幼苗之后，需用一層透明塑膠薄膜覆蓋以維持潮濕度。待24小時(shí)后去除塑膠膜。2.溫室環(huán)境為22℃，并進(jìn)行每日16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。定期澆水培養(yǎng)2-3個(gè)月。2.4.9擬南芥的花序浸染1.在對(duì)擬南芥進(jìn)行花序浸染處理之前，先將其豆莢和展開的花朵剪除；2.挑取農(nóng)桿菌培養(yǎng)皿中單一菌落加入5mL含kana和Rif的LB培養(yǎng)基中。28℃，180rpm，18h，4℃保存。3.將100μL的Kana和200μL的Rif溶入含200mLLB液體培養(yǎng)基的溶液中，充分振蕩使之混合均勻。再將此溶液分裝至150mL的錐形瓶中，確保兩種抗生素在錐形瓶中的工作濃度穩(wěn)定在50μg/mL。接著每瓶加入9μL的菌液，置于28℃下，以200rpm的速度小幅搖動(dòng)過夜培養(yǎng)。4.將已充分震蕩的菌株溶液添入含有抗生素Kan和Rif的100毫升LB培養(yǎng)基中，之后于搖床中以28℃、150rpm的條件下培養(yǎng)9至10小時(shí)，直至其OD600值達(dá)0.8至1.2；5.4℃，8000rpm,10min，去上清液，并使用事先準(zhǔn)備好的懸浮液重新吹打細(xì)菌，調(diào)整至OD600值為0.4至0.6；6.然后將栽培的擬南芥花序沉浸于含菌液的蔗糖懸浮液中，每棵植株處理時(shí)間為1min。隨后，對(duì)處理過的擬南芥進(jìn)行標(biāo)記，暗處培養(yǎng)12小時(shí)，之后將其移至光照培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。間隔三日再次進(jìn)行同樣的浸染處理，總計(jì)進(jìn)行三輪，完成后等待擬南芥達(dá)到成熟階段并收集種子。3結(jié)果與分析3.1白骨壤不同組織器官RNA的提取本實(shí)驗(yàn)對(duì)白骨壤不同組織器官進(jìn)行RNA的提取如圖3-1所示，提取的RNA中，28SrRNA條帶的亮度均超過18SrRNA條帶的兩倍，并且在電泳帶中未觀察到5SrRNA條帶，表明抽取的總RNA質(zhì)量很高，沒有降解現(xiàn)象發(fā)生。提取的總RNA中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨后將其作為PCR的模板，用于擴(kuò)增目的片段。圖3-1白骨壤AmSK32基因不同組織器官提總RNA注：1：花2：成熟果3：幼果4：幼葉5：成熟葉6：老葉7：幼根8：地下呼吸根9：地上呼吸根3.2白骨壤不同組織器官cDNA的驗(yàn)證表3-1cDNA驗(yàn)證反應(yīng)體系組分用量TemplatecDNAPrimerF(10μM)PrimerR(10μM)2×MagicGreenTaqSuperMixddH2O1μL0.5μL0.5μL5μL補(bǔ)足至10μL表3-2cDNA驗(yàn)證反應(yīng)程序程序名稱溫度時(shí)間Stage1預(yù)變性95℃3minStage2循環(huán)反應(yīng)95℃58℃72℃10sec10sec20secStage3徹底延伸72℃5min注：程序Stage2為30-35cycles將提取得到的RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將cDNA進(jìn)行PCR瓊脂糖凝膠電泳鑒定如圖3-2所示，獲得了大小約為100bp左右的條帶，符合預(yù)期可作為模板后續(xù)對(duì)AmSK32基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆。圖3-2白骨壤AmSK32基因不同組織器官cDNA驗(yàn)證注：1：花2：成熟果3：幼果4：幼葉5：成熟葉6：老葉7：幼根8：地下呼吸根9：地上呼吸根3.3AmSK32在白骨壤組織中的表達(dá)分析利用RT-qPCR對(duì)AmSK32基因在白骨壤不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示如圖3-3所示，在正常生長(zhǎng)條件下，AmSK32在花器官中的表達(dá)量較高；隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育，該基因的幼葉、成熟葉和老葉中的表達(dá)呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)；表明AmSK32基因在白骨壤不同組織中及同一組織不同生長(zhǎng)發(fā)育階段可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用。圖3-3白骨壤AmSK32基因組織表達(dá)模式圖3.4AmSK32目的基因全長(zhǎng)的克隆以白骨壤根部cDNA為模板對(duì)AmSK32基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，全長(zhǎng)克隆引物序列為：F：5′ATGAATATGATGCGTCGGGT3′，R：5′TCACTTCTTGGCATGCTCTG3′；反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下所示。表3-3AmSK32目的基因全長(zhǎng)克隆PCR反應(yīng)體系組分用量2×PhantaMaxMasterMix上游引物（10μM）下游引物（10μM）cDNAddH2O5μL0.5μL0.5μL1μL補(bǔ)足至10μL表3-4AmSK32目的基因全長(zhǎng)克隆PCR反應(yīng)程序程序名稱溫度時(shí)間Stage1預(yù)變性95℃3minStage2循環(huán)反應(yīng)95℃60.5℃72℃15sec15sec1min30secStage3徹底延伸72℃5min注：程序Stage2為32cycles用2×MagicGreenTaqSuperMix試劑盒（吐露港，中國(guó)）驗(yàn)證AmSK32全長(zhǎng)基因克隆引物，設(shè)置55.3℃、56.7℃、58.3℃、60.5℃4個(gè)梯度退火溫度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。，從圖3-4可知AmSK32基因的引物條帶在60.5℃退火溫度較明亮,可繼續(xù)用高保真酶進(jìn)行AmSK32全長(zhǎng)基因的克隆。通過圖3-5可知獲得大小約1400bp的片段,條帶大小符合預(yù)期表明已獲得目的基因可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖3-4白骨壤AmSK32基因克隆引物驗(yàn)證圖3-5AmSK32全長(zhǎng)基因的瓊脂糖凝膠電泳3.5質(zhì)粒線性化我們選用pBinGlyRed3-35S質(zhì)粒作為載體，pBinGlyRed載體上含有編碼紅色熒光蛋白的基因，如圖3-6所示。圖3-6pBinGlyRed質(zhì)粒圖限制性內(nèi)切酶選用XmaⅠ和EcoRⅠ，對(duì)pBInGlyRED載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，制備線性化載體，雙酶切體系如表3-5所示。表3-5雙酶切質(zhì)粒反應(yīng)體系組分用量質(zhì)粒Red10×NEBufferEcoRⅠXmaⅠddH2O10μL5μL1μL1μL補(bǔ)足至50μL上述反應(yīng)體系于PCR儀中37℃孵育30min。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行膠回收。3.6重組載體構(gòu)建表3-6重組載體反應(yīng)體系組分用量5×CEIIBufferExnaseII插入片段線性化載體ddH2O1μL0.5μL2μL1.5μL補(bǔ)足至5μL將上述體系放在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，溫度設(shè)為37℃，時(shí)長(zhǎng)設(shè)為30min，結(jié)束后將反應(yīng)液－20℃保存或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.7大腸桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，獲取單克隆如圖3-7所示。對(duì)培養(yǎng)皿中單菌落挑取進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖3-8所示，獲得了約為1500bp大小的條帶，符合預(yù)期，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖3-7大腸桿菌培養(yǎng)在含kana的LB平板上表3-7大腸桿菌菌液PCR反應(yīng)體系組分用量大腸桿菌菌液PrimerFPrimerR2×MagicGreenTaqSuperMixddH2O1μL0.5μL0.5μL5μL3μL表3-8大腸桿菌菌液PCR反應(yīng)程序程序名稱溫度時(shí)間Stage1預(yù)變性95℃3minStage2循環(huán)反應(yīng)95℃56℃72℃10sec10sec1min50secStage3徹底延伸72℃5min注：程序Stage2為30-35cycles圖3-8AmSK32基因大腸桿菌菌液PCR鑒定注：1-16為AmSK32大腸桿菌菌液3.8重組質(zhì)粒的提取及驗(yàn)證在大腸桿菌菌液PCR后，根據(jù)結(jié)果挑選3個(gè)PCR條帶明亮且單一的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取，將提取出來的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳如圖3-9所示，條帶大小符合預(yù)期，表明質(zhì)粒質(zhì)量和完整性符合要求，可送出測(cè)序，通過圖3-10可以確認(rèn)質(zhì)粒載體上的其他重要序列完整，插入的目的基因序列正確。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。圖3-9質(zhì)粒AmSK32電泳圖注;1為AmSK32-9-1、2為AmSK32-9-2圖3-10測(cè)序結(jié)果與AmSK32CDS比較3.9農(nóng)桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選挑取單菌落搖菌進(jìn)行菌液PCR。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖3-11所示，圖中可知，通過PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳獲得了大小約1400bp的條帶，符合預(yù)期，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。表3-9農(nóng)桿菌菌液PCR反應(yīng)體系組分用量農(nóng)桿菌菌液PrimerFPrimerR2×MagicGreenTaqSuperMixddH2O1μL0.5μL0.5μL5μL3μL表3-10農(nóng)桿菌菌液PCR反應(yīng)程序程序名稱溫度時(shí)間Stage1預(yù)變性95℃3minStage2循環(huán)反應(yīng)95℃56℃72℃10sec10sec1min50secStage3徹底延伸72℃5min注：程序Stage2為35cycles圖3-11AmSK32基因農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定注：1-8為AmSK32農(nóng)桿菌菌液3.10擬南芥浸染目前用于研究擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化的方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法如圖3-12所示?；ㄐ蚪痉ǖ膬?yōu)點(diǎn)在于其簡(jiǎn)便性、高效性以及穩(wěn)定性。通過這種方法，研究人員可以直接獲得轉(zhuǎn)基因種子，從而進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和分析。圖3-12花序浸染法注：a圖為擬南芥苗、b圖為將擬南芥倒置在含有AmSK32基因菌液的懸浮液中3.11陽(yáng)性苗篩選將轉(zhuǎn)基因擬南芥收種后用鹵素?zé)粽丈?，選擇被激發(fā)后呈現(xiàn)紅色的種子，從而得到轉(zhuǎn)基因種子，發(fā)現(xiàn)擬南芥T0代種子在鹵素?zé)粝路N子呈現(xiàn)紅色。表明AmSK32-OE載體已成功轉(zhuǎn)入擬南芥。擬南芥T1代轉(zhuǎn)基因幼苗長(zhǎng)至2-4片真葉時(shí)，對(duì)20株擬南芥提取DNA，進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。圖3-13可知，除1、13兩株系擬南芥外，其余植株條帶大小符合預(yù)期目的基因片段大小?？烧f明這18株擬南芥為陽(yáng)性苗。圖3-13轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR陽(yáng)性鑒定注：1-20為AmSK32T1擬南芥株系、WT為野生型擬南芥3.12結(jié)論我們研究了AmSK32基因在應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中的功能，分析了其表達(dá)模式和對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明，AmSK32基因在不同組織中的表達(dá)水平存在顯著差異，提示了其在白骨壤中具有一定的組織特異性。通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，AmSK32基因在葉片和根部的表達(dá)量存在差異，可能參與了抗鹽脅迫的過程。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)了AmSK32基因?qū)}脅迫的表達(dá)量高。AmSK32基因表達(dá)模式分析：AmSK32在花器官中的表達(dá)量較高；隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育，該基因的幼葉、成熟葉和老葉中的表達(dá)呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)；表明AmSK32基因在白骨壤不同組織中及同一組織不同生長(zhǎng)發(fā)育階段可能發(fā)揮不同的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)通過提取白骨壤中的AmSK32基因并進(jìn)行鹽實(shí)驗(yàn)，有望進(jìn)一步明確該基因在調(diào)控白骨壤鹽脅迫響應(yīng)方面的功能。這不僅有助于深入了解白骨壤的耐鹽機(jī)制，還可能為其他林木抗逆品種的培育提供新的候選基因和理論依據(jù)。有望為解決土壤鹽漬化問題提供新的思路和方法。同時(shí)，這也將有助于推動(dòng)分子育種技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。3.13后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排1.陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥AmSK32表達(dá)量檢測(cè)。2.繼續(xù)種植T2代觀察表型。3.獲取T3代轉(zhuǎn)基因株系。開展鹽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)擬南芥生化指標(biāo)及鹽markergene表達(dá)量進(jìn)一步明確AmSK調(diào)控白骨壤鹽脅迫響應(yīng)功能。參考文獻(xiàn)張志強(qiáng),徐中民,程國(guó)棟,等.黑河流域張掖地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)恢復(fù)的條件價(jià)值評(píng)估[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2002,(06):885-893.張麗,陳豐酆,王紅霞,等.甘薯類胡蘿卜素的代謝調(diào)控研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2023,31(08):1719-1729.杜照奎,陳河&

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