3-動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單元三動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)：技能目標(biāo)：1.理解動(dòng)物細(xì)胞發(fā)展大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)簡(jiǎn)史。2.了解動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法。3.熟悉常見(jiàn)的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式。4.了解動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生物反應(yīng)器的原理和特點(diǎn)。5.認(rèn)識(shí)新型動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器---微載體培養(yǎng)的魅力。1.能根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性選擇適當(dāng)?shù)拇笠?guī)模培養(yǎng)常用方法。2.熟練掌握大規(guī)模培養(yǎng)的操作和分析工藝影響。3.能把握大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器的發(fā)展趨勢(shì)。教學(xué)目標(biāo)重點(diǎn)：難點(diǎn)：1.動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和大規(guī)模培養(yǎng)方法的相適應(yīng)性。2.大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式和對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的工藝控制原則。1.不同動(dòng)物細(xì)胞適合的大規(guī)模培養(yǎng)方法。2.常見(jiàn)的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式。3.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生物反應(yīng)器的原理、特點(diǎn)和適合培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型。新課引入

近數(shù)十年來(lái)，由于人類(lèi)對(duì)生長(zhǎng)激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)從動(dòng)物組織獲取生物制品，產(chǎn)量少、質(zhì)量不均且不宜控制穩(wěn)定，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足這一需求。

隨著細(xì)胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善，能進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)用的生物反應(yīng)器種類(lèi)越來(lái)越多，規(guī)模也越來(lái)越大。人工條件下（pH、溫度、溶氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)我們稱(chēng)為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介一動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法二大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式三動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介四微載體培養(yǎng)技術(shù)五一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介

動(dòng)物細(xì)胞是一種無(wú)細(xì)胞壁的真核細(xì)胞，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)，除了要滿(mǎn)足培養(yǎng)過(guò)程必需的營(yíng)養(yǎng)要求外，有必要建立合理的控制模型，進(jìn)行pH和溶氧（DO）的最佳控制。細(xì)胞生物反應(yīng)器就是可以大規(guī)模體外培養(yǎng)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。通過(guò)微機(jī)有序地定量地控制加入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮?dú)夂投趸妓姆N氣體的流量，使其保持最佳的比例來(lái)控制細(xì)胞培養(yǎng)液中的pH值和溶氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿(mǎn)足動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)pH值和溶解氧的需要。返回一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介

20世紀(jì)60～70年代，可用于大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)誕生了。在過(guò)去幾十年來(lái)，大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器（Bioreactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。徹底改善了第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)核心問(wèn)題—難以產(chǎn)業(yè)化或者說(shuō)是規(guī)?；a(chǎn)，不但工藝生產(chǎn)能大規(guī)模制備產(chǎn)品；還能保證批量生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和很好方便的質(zhì)量控制。

目前大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、α、β和γ干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長(zhǎng)激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介

由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，因此人們對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)從傳統(tǒng)產(chǎn)品到新型應(yīng)用發(fā)生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤其是那些相對(duì)較大、較復(fù)雜或糖基化的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。

60年代初，英國(guó)AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200mL和800mL玻璃容器開(kāi)始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。1967年以后，英國(guó)Wellcome集團(tuán)分布于歐洲、非洲和南美洲8個(gè)國(guó)家的生產(chǎn)廠(chǎng)商，應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬疫苗，到1983年，Wellcome公司就已能夠利用動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，目前已掌握了5000L的細(xì)胞罐大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，另外還采用8000LNamalwa細(xì)胞生產(chǎn)α干擾素。此外，英國(guó)Celltech公司可以用氣升式生物反應(yīng)器生α、β和γ干擾素；用無(wú)血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國(guó)Endotronic公司用中空纖維生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長(zhǎng)激素等。二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器要求控制條件精確、方便可行，因此了解在反應(yīng)器中動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、不同細(xì)胞類(lèi)型所需生存條件、工藝控制參量等，對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)操作非常重要。

返回（一）培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)生長(zhǎng)特性1細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)型2培養(yǎng)需要的溫度3二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法（一）培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)1．生長(zhǎng)特性動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中，絕大數(shù)細(xì)胞所具有的生長(zhǎng)特性有：（1）細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素；（2）細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差；（3）需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌；（4）群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)；（5）培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外，分離純化成本高；（6）原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回（一）培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)2．細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)型依據(jù)在體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)依賴(lài)性差異，動(dòng)物細(xì)胞可分為兩類(lèi)：（1）貼壁依賴(lài)型細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長(zhǎng)，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類(lèi)。（2）非貼壁依賴(lài)型細(xì)胞：無(wú)需附著于固相表面即可生長(zhǎng)，包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回（一）培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)3．培養(yǎng)需要的溫度培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度相當(dāng)于各種細(xì)胞或組織取材機(jī)體的正常溫度。人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度為35℃～37℃。偏離這一溫度，細(xì)胞正常的代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至死亡?？偟膩?lái)說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐力比高溫高。溫度不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比；細(xì)胞培養(yǎng)置于39℃～40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復(fù)；當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時(shí)，許多細(xì)胞將死亡。當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時(shí)，細(xì)胞原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平。二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法貼壁培養(yǎng)1懸浮培養(yǎng)2固定化培養(yǎng)3二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的類(lèi)型和需要的條件，可采用

、

和等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)固定化培養(yǎng)二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法1．貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。（1）生長(zhǎng)特性貼壁依賴(lài)型細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿(mǎn)培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。（2）貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)①容易更換培養(yǎng)液。細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。②容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的。因細(xì)胞固定表面，不需過(guò)濾系統(tǒng)。③當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞更有效表達(dá)產(chǎn)品。④同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例。⑤適用于所有類(lèi)型細(xì)胞。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回1．貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。（3）貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)與懸浮培養(yǎng)法相比，貼壁培養(yǎng)也具有一些缺點(diǎn)：①擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；②占地面積大；③不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。（4）細(xì)胞貼壁表面要求具有凈陽(yáng)電荷和高度表面活性，對(duì)微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽(yáng)電荷。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法1．貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。（5）貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。①轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過(guò)渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器―轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡(jiǎn)單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點(diǎn)。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)也有其缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受到限制等?，F(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩類(lèi)。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法1．貼壁培養(yǎng)細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。（5）貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)②貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器：細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動(dòng)，比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，故多用于制備用量較小、價(jià)值高的生物藥品。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法二、動(dòng)物細(xì)z大規(guī)模培養(yǎng)常用方法2．懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程。主要用于非貼壁依賴(lài)型細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動(dòng)物來(lái)源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回3．固定化培養(yǎng)將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來(lái)，再進(jìn)行培養(yǎng)。具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易于產(chǎn)物分開(kāi)，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價(jià)貼附法、離子/共價(jià)交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。（1）吸附法用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。（2）共價(jià)貼附法利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法。（3）離子/共價(jià)交聯(lián)法雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會(huì)在細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞方法稱(chēng)為離子/共價(jià)交聯(lián)法。（4）包埋法將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法。（5）微囊法是用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法制備微囊中應(yīng)注意：①溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；②所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害；③膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)；④膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回（三）抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡1基因抗凋亡2化學(xué)方法抗凋亡3二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法（三）抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡中占主要部分。最近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細(xì)胞的死亡中80%是凋亡所導(dǎo)致，而不是以前所認(rèn)為的壞死。在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的最大障礙，因此理論上講減少凋亡，防止死亡或延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，可以極大提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。細(xì)胞凋亡由一系列基因精確地調(diào)控，是多細(xì)胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識(shí)別一個(gè)4氨基酸序列，并在識(shí)別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識(shí)別的序列，可以切割活化自身而導(dǎo)致信號(hào)放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級(jí)聯(lián)放大，最終作用于效應(yīng)蛋白，引起細(xì)胞凋亡。所以在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)干擾細(xì)胞在培養(yǎng)中凋亡的發(fā)生，提高細(xì)胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度、延長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)周期，從而提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量2～3倍。二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法1．營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡在常規(guī)生物反應(yīng)器構(gòu)造中，營(yíng)養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長(zhǎng)因子則引起凋亡，例如血清、糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)可抑制凋亡、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見(jiàn)的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。（三）抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回2．基因抗凋亡與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對(duì)其進(jìn)行正、負(fù)向的調(diào)控，因此可通過(guò)導(dǎo)入相應(yīng)基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凋亡活性。（三）抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回3．化學(xué)方法抗凋亡凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化如改變細(xì)胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號(hào)階段發(fā)生，其它的如破壞線(xiàn)粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在絕大多數(shù)細(xì)胞死亡中是相同的。因此，阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止或至少延遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，運(yùn)用化學(xué)物質(zhì)可抑制信號(hào)效應(yīng)階段的發(fā)生，被認(rèn)為是抗調(diào)亡策略之一。（三）抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法返回三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式

細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作可分為：、、、

和

五種。

分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式灌注式返回三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)5動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（六）細(xì)胞工廠(chǎng)培養(yǎng)1．分批式培養(yǎng)概念2．分批式培養(yǎng)方式的特點(diǎn)1．流加式培養(yǎng)概念2．流加式培養(yǎng)的特點(diǎn)3．流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分4．流加式培養(yǎng)種類(lèi)型1．半連續(xù)式培養(yǎng)概念2．半連續(xù)式特點(diǎn)1．連續(xù)式培養(yǎng)概念2．連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)3．連續(xù)式培養(yǎng)缺點(diǎn)

1．灌流式培養(yǎng)概念2．灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)（一）分批式培養(yǎng)（二）流加式培養(yǎng)（三）半連續(xù)式培養(yǎng)（四）連續(xù)式培養(yǎng)（五）灌流式培養(yǎng)1．分批式培養(yǎng)概念細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。在分批培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)分為五個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。培養(yǎng)周期多在3～5d，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48～72h）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。（一）分批式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式返回2．分批式培養(yǎng)方式的特點(diǎn)（1）操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過(guò)程中與外部環(huán)境沒(méi)有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制，操作簡(jiǎn)單，容易掌握。（2）直觀(guān)反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程。因培養(yǎng)期間細(xì)胞生長(zhǎng)代謝是在一個(gè)相對(duì)固定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分，因此可直觀(guān)的反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程，是動(dòng)物細(xì)胞工藝基礎(chǔ)條件或“小試”研究常用的手段。（3）可直接放大。由于培養(yǎng)過(guò)程工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過(guò)程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握。在工業(yè)化生產(chǎn)中，分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法。（一）分批式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1．流加式培養(yǎng)概念在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程沒(méi)有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。（二）流加式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式返回2．流加式培養(yǎng)的特點(diǎn)（1）流加培養(yǎng)需根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過(guò)程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。（2）培養(yǎng)過(guò)程以低稀釋率流加，細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時(shí)間較長(zhǎng)，總細(xì)胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。（3）流加培養(yǎng)過(guò)程須掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個(gè)培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。（4）在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過(guò)程控制，比其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。（二）流加式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式流加培養(yǎng)是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝，也是近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?？梢蕴砑右淮?，也可添加多次，為了追求更高的細(xì)胞密度往往需要添加一次以上，直至細(xì)胞密度不再提高；可進(jìn)行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進(jìn)行添加，但為了盡可能的維持相對(duì)穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)均可以進(jìn)行添加。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)成分既不會(huì)過(guò)剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物，造成營(yíng)養(yǎng)利用效率下降而成為無(wú)效的利用，也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡。2．流加式培養(yǎng)的特點(diǎn)（二）流加式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式（1）葡萄糖葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。（2）谷氨酰胺谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而濃度較高會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。（3）氨基酸、維生素及其他主要包括營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽堿、生長(zhǎng)刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸。3．流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分（二）流加式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式（1）單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時(shí)期，開(kāi)始連續(xù)補(bǔ)加濃縮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達(dá)到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補(bǔ)加，最后將細(xì)胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時(shí)間內(nèi)。（2）反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在單一補(bǔ)料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個(gè)一定時(shí)間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過(guò)反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。4．流加式培養(yǎng)類(lèi)型（二）流加式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1．半連續(xù)式培養(yǎng)概念又稱(chēng)重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無(wú)需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過(guò)幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。（三）半連續(xù)式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式返回2．半連續(xù)式培養(yǎng)特點(diǎn)（1）培養(yǎng)物的體積逐步增加；（2）可進(jìn)行多次收獲；（3）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。（三）半連續(xù)式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1．連續(xù)式培養(yǎng)概念一種常見(jiàn)的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器。連續(xù)式培養(yǎng)模式將細(xì)胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過(guò)程可無(wú)限延續(xù)下去。（四）連續(xù)式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式返回2．連續(xù)式培養(yǎng)特點(diǎn)（1）細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)；（2）產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)；（3）可控制衰退期與下降期。連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率可維持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來(lái)的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。（四）連續(xù)式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式3．連續(xù)式培養(yǎng)缺點(diǎn)（1）由于是開(kāi)放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染；（2）在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；（3）對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。連續(xù)培養(yǎng)在連續(xù)高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片及時(shí)清除，細(xì)胞活性高最終細(xì)胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋?zhuān)蚨a(chǎn)物濃度并未提高；尤其是細(xì)胞和產(chǎn)物不斷的稀釋?zhuān)斐蔂I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生成速率低下。（四）連續(xù)式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式1．灌流式培養(yǎng)把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開(kāi)始多采用微孔膜過(guò)濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開(kāi)發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器。（五）灌流式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式返回2．灌流式培養(yǎng)特點(diǎn)（1）細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107～109個(gè)/mL，較大提高產(chǎn)品的產(chǎn)量；（2）連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；（3）反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；（4）產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。這種方法最大困難是污染機(jī)率較高，長(zhǎng)期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過(guò)程中工程問(wèn)題。（五）灌流式培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式細(xì)胞工廠(chǎng)（cellfactory）是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠(chǎng)房空間，并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無(wú)菌性，從而避免因污染而帶來(lái)的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細(xì)胞工廠(chǎng)是目前應(yīng)用較多的細(xì)胞工廠(chǎng)系統(tǒng)?？捎糜谌缫呙?、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行放大時(shí)不會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)條件，可提供1，2，10和40盤(pán)的規(guī)格使放大變得簡(jiǎn)單易行，低污染風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測(cè)試保證最有利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)。同時(shí)，與NUNC的細(xì)胞工廠(chǎng)操作儀結(jié)合使用，可全面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化，從而大大地減低勞動(dòng)強(qiáng)度和密集度。這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類(lèi)似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯制成，使用后可隨意處理。（六）細(xì)胞工廠(chǎng)培養(yǎng)三、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式返回動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關(guān)鍵在于能否設(shè)計(jì)出合適的生物反應(yīng)器。由于動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞有很大差異，傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器顯然不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。首先必須滿(mǎn)足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)物的合成。四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介生物反應(yīng)器分類(lèi)(一)攪拌罐生長(zhǎng)反應(yīng)器(二)氣升式生物反應(yīng)器(三)鼓泡式生物反應(yīng)器(四)中空纖維生物反應(yīng)器(五)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大(六)（一）生物反應(yīng)器分類(lèi)目前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。按其培養(yǎng)細(xì)胞的方式不同，這些生物反應(yīng)器可分為以下三類(lèi)：1．懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；2．貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器；3．包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介返回（二）攪拌罐生長(zhǎng)反應(yīng)器 這是最經(jīng)典、最早被采用的一種生物反應(yīng)器。此類(lèi)反應(yīng)器與傳統(tǒng)的微生物生物反應(yīng)器類(lèi)似，針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過(guò)攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細(xì)胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞?，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器、海船式攪拌器等。四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介返回（三）氣升式生物反應(yīng)器

1979年首次應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器成功的進(jìn)行了動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)：1．罐內(nèi)液體流動(dòng)溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對(duì)細(xì)胞損傷較??；2．可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；3．液體循環(huán)量大，細(xì)胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；4．結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，利于密封并降低了造價(jià)。常用的氣升式反應(yīng)器有三種：內(nèi)循環(huán)式氣升式、外循環(huán)式氣升式、內(nèi)外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介返回（四）鼓泡式生物反應(yīng)器與氣升式反應(yīng)器相類(lèi)似，是利用氣體鼓泡來(lái)進(jìn)行供氧及混合，其設(shè)計(jì)原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介返回原理中空纖維生物反應(yīng)器用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。原理：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長(zhǎng)微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長(zhǎng)。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時(shí)纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無(wú)血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)半透膜從管內(nèi)滲透出來(lái)供細(xì)胞生長(zhǎng)；對(duì)于血清等大分子營(yíng)養(yǎng)物，則必須從管外灌入，否則會(huì)被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過(guò)半透膜滲入管內(nèi)，避免了過(guò)量代謝物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。（五）中空纖維生物反應(yīng)器四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介返回優(yōu)點(diǎn)中空纖維生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是：1．占地空間少；2．細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)；3．生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞。（五）中空纖維生物反應(yīng)器四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)的總體考慮（1）結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，能耐受蒸汽滅菌，采用對(duì)生物催化劑無(wú)害和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑無(wú)死角，內(nèi)部附件盡量減少，以維持純種培養(yǎng)需要；（2）有良好的氣—液接觸和液—固混和性能和熱量交換性能，使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進(jìn)行；（3）保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下，盡量節(jié)省能源消耗；（4）減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以提高裝料系數(shù)，并有必要可靠的參數(shù)檢測(cè)和控制儀表并能與計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)。（六）生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介返回生物反應(yīng)器的放大一種新的生物技術(shù)產(chǎn)品從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，會(huì)遇到生物反應(yīng)器的逐級(jí)放大問(wèn)題，每一級(jí)約放大10倍～100倍。生物反應(yīng)器的放大，表面看來(lái)僅是一個(gè)體積或尺度放大問(wèn)題，實(shí)際上并不是那么簡(jiǎn)單。反應(yīng)器放大研究雖已提出了不少方法，但還沒(méi)有一種是普遍都能適用的。目前還只能是半理論半經(jīng)驗(yàn)的，即抓住反應(yīng)過(guò)程中的少量關(guān)鍵性參數(shù)或現(xiàn)象進(jìn)行放大。（六）生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和放大四、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介五、微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介（一）微載體理論（二）微載體培養(yǎng)原理與操作（三）微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)（四）微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)（五）返回（一）微載體培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介微載體培養(yǎng)技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)三十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類(lèi)型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BIOSTATCplus反應(yīng)器，使用雙槳葉無(wú)氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGen

PlusTM和Bioflo-3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。五、微載體培養(yǎng)技術(shù)返回原理微載體是指直徑在60～250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第一種微載體問(wèn)世以來(lái)，國(guó)際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類(lèi)型已經(jīng)達(dá)十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3，Cytopore和Cytoline。（二）微載體理論五、微載體培養(yǎng)技術(shù)返回（二）微載體理論五、微載體培養(yǎng)技術(shù)返回微載體特點(diǎn)1．微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)表面積（S/F）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100～200μm之間。2．微載體的密度：一般為1.03～1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。3．微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過(guò)大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。（二）微載體理論五、微載體培養(yǎng)技術(shù)原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆?！⑤d體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴(lài)性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。相融性與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。（三）微載體培養(yǎng)原理與操作五、微載體培養(yǎng)技術(shù)返回影響因素?cái)嚢柁D(zhuǎn)速：由于動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。通常的操作方式是在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。影響細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)的因素很多，主要有三個(gè)方面：（1）在細(xì)胞方面，如細(xì)胞群體、狀態(tài)和類(lèi)型。（2）在微載體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。（3）在培養(yǎng)環(huán)境中，如培養(yǎng)基組成、溫度、pH以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。（三）微載體培養(yǎng)原理與操作五、微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)（1）培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種細(xì)胞至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以