檢驗(yàn)儀器分析技術(shù) 課件 第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器

第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀目錄第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器第二節(jié)生物芯片第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀第四節(jié)全自動DNA測序儀1.掌握PCR擴(kuò)增儀、蛋白質(zhì)測序儀、全自動DNA測序儀及生物芯片的工作原理。2.熟悉PCR擴(kuò)增儀、蛋白質(zhì)測序儀、全自動DNA測序儀及生物芯片的基本結(jié)構(gòu)、使用、維護(hù)與常見故障處理。3.了解PCR擴(kuò)增儀、蛋白質(zhì)測序儀、全自動DNA測序儀及生物芯片的臨床應(yīng)用。學(xué)習(xí)目標(biāo)第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。PCR定義聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡稱PCR。第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀PCR技術(shù)原理一、PCR擴(kuò)增儀的工作原理PCR技術(shù)原理第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀一、PCR擴(kuò)增儀的工作原理PCR反應(yīng)過程第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀PCR技術(shù)原理一、PCR擴(kuò)增儀的工作原理PCR反應(yīng)過程第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀PCR技術(shù)原理一、PCR擴(kuò)增儀的工作原理30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量循環(huán)數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,824第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀PCR技術(shù)原理一、PCR擴(kuò)增儀的工作原理1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀一、PCR擴(kuò)增儀的工作原理第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀二、PCR擴(kuò)增儀的分類按溫控方式水浴式PCR儀變溫金屬塊式PCR儀變溫氣流式PCR第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀二、PCR擴(kuò)增儀的分類水浴式PCR儀由三個不同溫度的水浴槽和機(jī)械臂組成變溫金屬塊式PCR儀中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數(shù)目甚至不同規(guī)格的凹孔，用來放置樣品管變溫氣流式PCR儀由機(jī)殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀二、PCR擴(kuò)增儀的分類原位PCR儀由普通PCR儀衍生出的帶原位擴(kuò)增功能的基因擴(kuò)增儀其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內(nèi)可垂直放一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，控溫很精確配有支持原位PCR模塊的PCR儀可以一機(jī)兩用，比較經(jīng)濟(jì)SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀

第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)熒光檢測系統(tǒng)激發(fā)光源檢測器擴(kuò)增系統(tǒng)實(shí)時熒光定量PCR儀的基本結(jié)構(gòu)16熒光檢測系統(tǒng)

激發(fā)光源

檢測器

發(fā)光二極管

鹵鎢燈光源

超低溫CCD

光電倍增管實(shí)時熒光定量PCR儀的熒光檢測系統(tǒng)第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)ABI7500熒光定量PCR儀MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀

第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀LightCycleTM熒光定量PCR儀第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)實(shí)時熒光定量PCR儀

金屬板式實(shí)時定量PCR儀離心式實(shí)時定量PCR儀

各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀

第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)可作為普通PCR儀使用可帶梯度功能可容納的樣本量大，無需特殊耗材溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)金屬板式實(shí)時定量PCR儀

離心式實(shí)時定量PCR儀

溫度均一性較好使用的是同一個激發(fā)光源和檢測器可容納樣品量少有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)LightCycleTM熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)各孔獨(dú)立控溫定量PCR儀不同樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊各孔獨(dú)立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨(dú)特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀三、PCR擴(kuò)增儀的基本結(jié)構(gòu)普通PCR儀使用方法開機(jī)：打開電源開關(guān)，儀器自檢放入樣本管，關(guān)緊蓋子設(shè)置運(yùn)行程序（主要是時間、溫度等參數(shù)）等或調(diào)出儲存的程序運(yùn)行即可在儀器使用完后，我們通常先關(guān)閉軟件，再關(guān)閉PCR儀，最后關(guān)閉電腦（一）PCR擴(kuò)增儀的使用方法第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀四、PCR擴(kuò)增儀的使用、維護(hù)與常見故障處理

設(shè)置一個PCR體系則一般分為8步：

①

預(yù)變性：可用94～95℃，2～10分鐘,一般用5分鐘。

②

變性：一般用94℃，30秒~2分鐘,一般45秒~1分鐘。

③

退火：溫度自定，30秒~2分鐘。

（一）PCR擴(kuò)增儀的使用方法第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀四、PCR擴(kuò)增儀的使用、維護(hù)與常見故障處理

④

延伸：70～75℃，一般72℃。

⑤

循環(huán)數(shù)：一般25～35個循環(huán)。

⑥

最終延伸：72℃，5～15分鐘。

⑦

保存：10℃，時間設(shè)為0。

⑧

結(jié)束，關(guān)機(jī)。

定量PCR擴(kuò)增儀的操作和普通PCR儀基本相同。第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀（一）PCR擴(kuò)增儀的使用方法四、PCR擴(kuò)增儀的使用、維護(hù)與常見故障處理

1.注意本機(jī)的使用環(huán)境條件和電源；

2.機(jī)蓋開關(guān)要輕，以防損壞蓋鎖；

3.嚴(yán)禁工作時打開機(jī)蓋；

4.定期用中性肥皂水清洗樣品槽，嚴(yán)禁使用強(qiáng)堿、有機(jī)溶液和高濃度酒精擦洗；

5.有故障時請有專業(yè)知識的維修人員或廠家技術(shù)人員維修。第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀（二）儀器的維護(hù)保養(yǎng)四、PCR擴(kuò)增儀的使用、維護(hù)與常見故障處理①

熒光染料污染樣品孔；②

PCR管融化，原因可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題；③

個別孔擴(kuò)增效率差異很大，可能的原因是半導(dǎo)體模塊出現(xiàn)壞點(diǎn)；④

熒光強(qiáng)度減弱或不穩(wěn)定，產(chǎn)生的原因有濾光片發(fā)霉或有水汽，或光源損耗（以鹵鎢燈為光源的），需更換光源；或需調(diào)節(jié)檢測元件靈敏度；⑤

儀器工作時出現(xiàn)噪音。以上故障部分可自行檢查，部分需工程師檢修。第一節(jié)PCR擴(kuò)增儀（三）儀器的常見故障處理四、PCR擴(kuò)增儀的使用、維護(hù)與常見故障處理第九章

臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器第二節(jié)生物芯片生物芯片,又稱微陣列。生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期隨著人類基因組研究的深入應(yīng)運(yùn)而生的一種分子生物學(xué)技術(shù)，其起源于DNA雜交探針技術(shù)與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，因具有芯片相似的微型化和大規(guī)模分析、高通量處理生物信息的特點(diǎn)而具有廣泛的應(yīng)用前景。生物芯片技術(shù)在核酸測序、基因診斷、基因表達(dá)差異分析、基因突變檢測、基因多態(tài)性分析、外源微生物感染鑒定以及臨床藥物篩選等方面得到廣泛應(yīng)用。一、生物芯片的工作原理及分類生物芯片技術(shù)是根據(jù)生物分子間特異性相互作用的原理，將生化分析過程集成于芯片表面，設(shè)計(jì)其中一方為探針，并固定于微小的載體表面，通過分子間的特異性反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分的高通量快速檢測。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，生物芯片可以分為不同的類型分類依據(jù)生物芯片的類型基片上交聯(lián)固定的識別分子種類不同基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、肽芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片及寡核苷酸芯片等表面化學(xué)修飾物的不同多聚賴氨酸修飾芯片、氨基修飾芯片、醛基修飾芯片固相支持物的不同無機(jī)芯片和有機(jī)芯片結(jié)構(gòu)特征分析過程不同微陣列芯片（以親和結(jié)合技術(shù)為核心）和微流控芯片（以微管網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征）生物化學(xué)反應(yīng)過程不同樣品制備芯片、生化反應(yīng)芯片和檢測芯片用途不同分析芯片、檢測芯片和診斷芯片功能不同測序芯片、基因作圖芯片、基因表達(dá)譜芯片、突變檢測芯片、多態(tài)性分析芯片等二、生物芯片的基本組成生物芯片實(shí)質(zhì)上是一種微型化的生化分析儀器，主要由芯片制備系統(tǒng)、樣品制備系統(tǒng)、芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)、雜交反應(yīng)系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析等系統(tǒng)等幾部分組成。二、生物芯片的基本組成（一）芯片制備系統(tǒng)目前制備芯片采用表面化學(xué)方法或組合化學(xué)的方法來處理固相基質(zhì)（玻璃片或硅片），然后使用DNA片段或蛋白質(zhì)分子按特定順序排列在芯片片基上，芯片制備及其質(zhì)量在生物芯片分析系統(tǒng)中起著決定性的作用。二、生物芯片的基本組成（二）樣品制備系統(tǒng)生物樣品的制備和處理是基因芯片技術(shù)的第二個重要環(huán)節(jié)。樣品的純度和雜交特異性直接決定芯片的質(zhì)量和可信度。因此，將樣品進(jìn)行特定的生物處理，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA等信息分子并加以標(biāo)記（為了獲得雜交信號），以提高檢測的靈敏度。標(biāo)記的方法有熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、放射性核素標(biāo)記法等。目前采用的主要是熒光標(biāo)記法，常使用的熒光物質(zhì)有：熒光素、羅丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。二、生物芯片的基本組成（三）芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)點(diǎn)樣法是將預(yù)先通過液相化學(xué)大量合成好的探針，或PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化和定量分析后，通過由陣列復(fù)制器或陣列點(diǎn)樣機(jī)及電腦控制的機(jī)器人，準(zhǔn)確、快速的將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。二、生物芯片的基本組成芯片點(diǎn)樣儀工作時環(huán)境必須保持潔凈，避免點(diǎn)樣時受到塵土等污染、相對濕度保持在45%～55%之間，以維持點(diǎn)樣系統(tǒng)的最佳狀態(tài)。為了保證樣點(diǎn)得到有效的質(zhì)量檢測，一般在點(diǎn)樣儀內(nèi)置樣點(diǎn)質(zhì)量控制裝置，可以定量的測定每個樣點(diǎn)的大小和體積，從根本上減少漏點(diǎn)現(xiàn)象，并且可以重新補(bǔ)充漏掉的樣品點(diǎn)。二、生物芯片的基本組成（四）雜交反應(yīng)系統(tǒng)雜交反應(yīng)要根據(jù)探針的類型、長度和研究目的來選擇合適的雜交條件，減少生物分子之間的錯配比率，從而獲得最能反映生物本質(zhì)的信號，是芯片檢測的關(guān)鍵。雜交反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，受很多因素的影響，如探針密度和濃度、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、雜交序列長度、GC含量和核酸二級結(jié)構(gòu)等。二、生物芯片的基本組成（五）信號檢測系統(tǒng)目前最常用的芯片信號檢測方法是將芯片置入芯片掃描儀中，通過采集各種反應(yīng)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度和熒光位置，經(jīng)相關(guān)軟件分析圖像，即可獲得有關(guān)生物信息。芯片掃描儀是芯片信號檢測的掃讀裝置，是對生物芯片進(jìn)行信號收集的關(guān)鍵。信號檢測系統(tǒng)必須具有高度敏感性，并能有效分辨噪聲信號。二、生物芯片的基本組成（六）數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)包括芯片圖像識別、數(shù)據(jù)提取、數(shù)據(jù)入庫、標(biāo)準(zhǔn)化處理和生物學(xué)分析等環(huán)節(jié)。一個完整的生物芯片配套軟件應(yīng)包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理軟件、數(shù)據(jù)提取或統(tǒng)計(jì)分析軟件，芯片表達(dá)基因的國際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫分析及積累。對所讀取的數(shù)據(jù)處理方面，應(yīng)用最廣泛的是聚類分析，此外，還有主成分分析、時間序列分析等。三、生物芯片的使用與維護(hù)（一）生物芯片的使用三、生物芯片的使用與維護(hù)（二）生物芯片的維護(hù)生物芯片各個分析系統(tǒng)必須要加強(qiáng)日常維護(hù)才能使儀器長久保持良好的工作狀態(tài)，才能使檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。①正確操作：操作人員應(yīng)熟悉各系統(tǒng)的性能特點(diǎn)，嚴(yán)格按照操作規(guī)程正確操作，應(yīng)避免儀器在正常工作時出現(xiàn)斷氣、斷電、斷水等情況，確保系統(tǒng)的正常運(yùn)行；②工作環(huán)境：清潔衛(wèi)生，防塵、防曬、防潮濕。溫度一般為5～35℃，溫度控制精度為±0.1℃，相對濕度應(yīng)低于80%，海拔高度應(yīng)低于2000米；③工作電壓：波動范圍一般不得超過±10%；④運(yùn)輸過程中避免劇烈震動，環(huán)境條件不可有劇烈變化；⑤不可將生物芯片滯留于檢測器上過長時間。⑥定期檢查和維護(hù)各個系統(tǒng)并認(rèn)真做好儀器的工作記錄。四、生物芯片的主要臨床應(yīng)用與傳統(tǒng)方法相比，生物芯片在疾病檢測診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，特別是對感染性疾病、遺傳性疾病和惡性腫瘤等的臨床診斷。它可以用一張芯片同時對多個患者進(jìn)行多種疾病的檢測。僅用極小量的樣品，在極短時間內(nèi)，即可為醫(yī)務(wù)人員提供大量的疾病診斷信息。四、生物芯片的主要臨床應(yīng)用1.遺傳疾病的診斷

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，許多遺傳性疾病的相關(guān)基因已被定位，為從基因水平上認(rèn)識遺傳疾病并進(jìn)行早期診斷奠定了基礎(chǔ)，如“血友病”、“地中海貧血”、“苯丙酮酸癥”、“杜氏肌營養(yǎng)不良癥”以及精神性疾病“帕金森氏病”等致病基因已經(jīng)定位,因此可將對應(yīng)于突變熱點(diǎn)區(qū)的寡核苷酸探針合成或點(diǎn)加于DNA芯片上,通過1次雜交完成待檢樣品多種突變可能性的篩查,實(shí)現(xiàn)對多種遺傳病的高效快速診斷。四、生物芯片的主要臨床應(yīng)用2.腫瘤疾病診斷

通過基因芯片對各種導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生的基因進(jìn)行檢測，能篩查健康人群中的潛在腫瘤發(fā)病基因，以達(dá)到早期診斷和預(yù)防的目的。例如應(yīng)用計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則和DNA芯片技術(shù)，嘗試了使用DNA芯片確定潛在癌抗原的可能性，研究者采用以計(jì)算法則為基礎(chǔ)的矩陣來預(yù)測人類白細(xì)胞抗原(HLA)類配體，并用于人結(jié)腸癌的差異表達(dá)基因分析，最終識別出一組結(jié)腸癌獨(dú)特的和具有潛在免疫原性的肽。四、生物芯片的主要臨床應(yīng)用3.傳染性疾病診斷物

目前許多細(xì)菌、病毒等病原體的基因組測序已經(jīng)完成，將許多代表各種微生物的特殊基因制成一張芯片，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄就可檢測樣品中有無病原體基因的表達(dá)及表達(dá)水平，由此判斷病人是否感染、病原感染進(jìn)程以及宿主反應(yīng)。生物芯片檢測基因表達(dá)差異，較小的細(xì)菌基因組可被制成包含該微生物的所有已知序列芯片用以確定被感染個體內(nèi)所有改變的基因，快速確定毒力基因利用相同的方法，還可在急性感染期和潛伏期研究病毒基因表達(dá)。四、生物芯片的主要臨床應(yīng)用同時生物芯片還在疫苗研制、遺傳藥理學(xué)、毒理學(xué)和病毒感染的快速診斷、病毒耐藥性突變檢測、中藥安全性的檢測、中藥材品質(zhì)的檢測、藥物基因組學(xué)、耐藥性分析、個體藥物研究等領(lǐng)域也有許多成功應(yīng)用。生物芯片技術(shù)發(fā)展至今，已成為一種常規(guī)且有效的研究手段，我們期待生物芯片運(yùn)用其獨(dú)特的優(yōu)勢特點(diǎn)做出更大的貢獻(xiàn)。第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀蛋白質(zhì)測序是指測定蛋白質(zhì)分子的氨基酸排列順序。目前的蛋白質(zhì)自動測序儀是從肽鏈的N端開始測序。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理

蛋白質(zhì)測序儀的工作原理：執(zhí)行全自動Edman化學(xué)降解反應(yīng)和游離氨基酸的分離與鑒定的過程。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理1.偶聯(lián)在弱堿條件下，蛋白質(zhì)和多肽的自由α-氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，生成PTC-多肽，與此同時其緊挨的第二個殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。這一反應(yīng)在45～48℃進(jìn)行約15分鐘，并用過量的試劑使有機(jī)反應(yīng)完全。

2.環(huán)化裂解在無水三氟醋酸（TFA）的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化，肽鏈斷裂形成噻唑啉酮苯氨（ATZ）衍生物和一個失去末端氨基酸的剩余多肽。緊挨的第二個氨基酸殘基暴露出自由的α-氨基，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

3.轉(zhuǎn)化ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，經(jīng)25%TFA處理轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的苯異硫甲脲氨基酸（PTH-氨基酸）第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理Edman化學(xué)降解法原理第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理4.轉(zhuǎn)化后的PTH氨基酸經(jīng)自動進(jìn)樣器注入高校液相色譜進(jìn)行在線檢測，根據(jù)PTH氨基酸的洗滌滯流時間確定每一種氨基酸類型。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理

余下的多肽鏈的酰胺鍵不受影響，可以進(jìn)行下一次降解循環(huán)，如此反復(fù)循環(huán)，可使多肽鏈N端氨基酸依次逐一降解。每次形成的PTH氨基酸通過蛋白質(zhì)自動測序儀內(nèi)的高效薄層層析系統(tǒng)或高效液相層析系統(tǒng)（HPLC）進(jìn)行實(shí)時分離檢測，根據(jù)PTH氨基酸保留值不同確定各種氨基酸。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理Edman化學(xué)降解法原理第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理

將每次斷裂下來鑒定的氨基酸依次拼接在一起就可以獲得完整的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。此法對樣品量的要求少，一般只需10~100pmol即可測定氨基酸序列。對于肽鏈較長的蛋白質(zhì)，可以先將其切斷成多個小肽，對這些小肽進(jìn)行氨基酸測序，然后進(jìn)行拼接。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理

上述反應(yīng)大致分為四個步驟，在蛋白質(zhì)自動測序儀的不同部位進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)和環(huán)化斷裂發(fā)生在反應(yīng)器中，轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)化器中進(jìn)行，PTH氨基酸的分析則在檢測器。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理固定樣品偶聯(lián)反應(yīng)斷裂反應(yīng)抽提轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)樣分離、檢測數(shù)據(jù)分析將蛋白質(zhì)樣品通過聚凝胺固定在玻璃纖維板，或者將轉(zhuǎn)印有蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的PVDF膜放置在反應(yīng)器中。在TMA（R2）溶液中將蛋白質(zhì)N末端氨基與PITC（R1)反應(yīng)，生成PTC-蛋白質(zhì)。使用乙酸乙脂（S2)清洗多余的化學(xué)試劑及生成的副產(chǎn)物。以TFA（R3)將PTC-蛋白質(zhì)N末端結(jié)合切斷，形成ATZ-氨基酸。使用氯丁烷（S3)將游離的ATZ-氨基酸從轉(zhuǎn)換器中抽提出來。Edman降解反應(yīng)器使用25%TFA溶液（R4)將ATZ-氨基酸轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定的PTH-氨基酸由乙氰溶液（S4B)溶解的PTH-氨基酸，經(jīng)進(jìn)樣器注入HPLC。由反向液相色譜系統(tǒng)分離、檢測PTH-氨基酸。紀(jì)錄、顯示數(shù)據(jù)，判定PTH-氨基酸、計(jì)算定量、回收率等。轉(zhuǎn)化器進(jìn)樣器HPLC數(shù)據(jù)處理蛋白質(zhì)測序分析流程圖第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀一、蛋白質(zhì)測序儀的工作原理

商品化的蛋白質(zhì)自動測序儀誕生以來，雖然其技術(shù)改進(jìn)不多，但仍是測定蛋白質(zhì)序列的黃金標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)自動測序儀的優(yōu)勢在于已被化學(xué)驗(yàn)證的精確性、系統(tǒng)初始投資較小，缺點(diǎn)主要是分析時間過長、測序長度過短（典型的范圍為20~50個氨基酸序列）。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀二、蛋白質(zhì)測序儀的基本結(jié)構(gòu)基本構(gòu)件進(jìn)樣器氨基酸分析系統(tǒng)靈敏度信息軟件系統(tǒng)反應(yīng)器第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀二、蛋白質(zhì)測序儀的基本結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)自動測序儀結(jié)構(gòu)示意圖第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀二、蛋白質(zhì)測序儀的基本結(jié)構(gòu)反應(yīng)器進(jìn)樣器進(jìn)行Edman化學(xué)降解反應(yīng)中偶聯(lián)反應(yīng)和環(huán)化裂解反應(yīng)。PTH氨基酸由有機(jī)溶劑（如乙腈）溶解后經(jīng)進(jìn)樣器注入HPLC。第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀二、蛋白質(zhì)測序儀的基本結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換器氨基酸分析系統(tǒng)ATZ衍生物在轉(zhuǎn)換器中經(jīng)有機(jī)溶劑（如氯丁烷）抽提出來，再經(jīng)25%TFA溶液作用轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定的PTH氨基酸。通常由高效液相色譜毛細(xì)管色譜柱組成，色譜柱分離是整個測序過程中最關(guān)鍵的一步。各種氨基酸通過這一系統(tǒng)會產(chǎn)生自己的特征吸收峰第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀二、蛋白質(zhì)測序儀的基本結(jié)構(gòu)信息軟件處理系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)主機(jī)完成：記錄和顯示數(shù)據(jù)，根據(jù)氨基酸的色譜峰來判斷為何種氨基酸第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀二、蛋白質(zhì)測序儀的基本結(jié)構(gòu)第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀三、蛋白質(zhì)測序儀的使用流動相的選擇采用與檢測器相匹配且粘度小的“HPLC”級溶劑，經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾去除纖維毛和未溶解的機(jī)械顆粒等，經(jīng)過0.2u的過濾可除去有紫外吸收的雜質(zhì)對試樣有適宜的溶解度水的等級需用純化水，裝水的溶劑瓶要經(jīng)常更換，連續(xù)幾天不使用儀器時，要將管路用甲醇清洗脫氣除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡成為脫氣。脫氣可防止由氣泡產(chǎn)生而引起的故障；可防止由溶解氣體量的變動引起的檢測不穩(wěn)定度分析柱在使用新柱或長時間未用的分析柱之前，最好用強(qiáng)溶劑在低流量下（0.2~0.3ml/min）沖洗30分鐘；定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子；使用緩沖鹽后，先用水沖洗4小時左右，再換有機(jī)溶劑（如甲醇）沖洗色譜柱和管路；凈化樣品；分離條件合適；不使用時蓋上蓋子，避免固定相干枯；使用預(yù)柱；避免流動相組成及極性的劇烈變化；避免壓力脈沖的劇烈變化。燈管氘燈不能夠頻繁開啟，否則容易損壞第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀三、蛋白質(zhì)測序儀的維護(hù)蛋白質(zhì)自動測序儀的常見故障及其處理辦法故障現(xiàn)象故障原因處理辦法管路中不斷有氣泡生成吸濾頭堵塞用5%-20%的稀硝酸超聲波清洗，再用蒸餾水清洗泵無法洗液或排液，流路不通寶石球粘附于墊片用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負(fù)壓，使寶石球與墊片分開拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗系統(tǒng)壓力波動大寶石球或塑料片受污導(dǎo)致密封不好拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗系統(tǒng)壓力波動大或漏液密封圈磨損而導(dǎo)致密封不良更換密封圈第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀三、蛋白質(zhì)測序儀的常見故障處理蛋白質(zhì)自動測序儀的常見故障及其處理辦法故障現(xiàn)象故障原因處理辦法系統(tǒng)壓力波動大或壓力偏高線路過濾器堵塞5%稀硝酸超聲波清洗漏液手動進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子密封損壞更換轉(zhuǎn)子密封載樣困難定量環(huán)堵塞或進(jìn)樣器污染清洗或更換定量環(huán)、進(jìn)樣器系統(tǒng)高壓、峰型變差、保留時間變化液相柱污染正相柱用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇清洗；反相柱用甲醇、乙腈、氯仿、異丙醇、0.05M稀硫酸清洗樣品池和參比池能量相差較大檢測器樣品池污染用針筒注入異丙醇清洗樣品池，如污染嚴(yán)重，拆開樣品池，將透鏡等放入異丙醇中超聲波清洗第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀三、蛋白質(zhì)測序儀的常見故障處理1.未知蛋白質(zhì)的鑒定2.基因工程研究3.蛋白質(zhì)或肽類純度的鑒定4.蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)組學(xué)研究5.核酸研究6.其他第三節(jié)蛋白質(zhì)測序儀四、蛋白質(zhì)測序儀的主要應(yīng)用第四節(jié)全自動DNA測序儀第九章臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)儀器DNA測序儀的工作原理基于：（一）

Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法（二）

Maxam-Gilbert化學(xué)降解法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理利用DNA的體外合成過程－－聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA聚合酶的催化以目的DNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對原則在引物的引導(dǎo)下單核苷酸聚合形成新DNA鏈第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理普通的PCR反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為4種2’-脫氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）dNTP結(jié)構(gòu)示意圖第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理測序反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）ddNTP結(jié)構(gòu)示意圖第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理ATemplatePrimerdNTPsPolymeraseTerminatorGCT（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（1）第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理TCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATTT雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（2）第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理T雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（3）第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理ACG雙脫氧鏈末端終止法測序反應(yīng)原理（4）由于存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段。第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對長度不等的新生鏈進(jìn)行分離，根據(jù)片段大小直接讀出新生DNA鏈序列。（一）雙脫氧鏈末端終止法測序原理第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理（二）熒光標(biāo)記DNA的檢測原理測序反應(yīng)一般以單引物進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，絕多數(shù)產(chǎn)物均為單鏈。反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)簡單純化處理就可以放置到自動測序儀中開始電泳。兩極間極高的電勢差推動著各個熒光DNA片段在凝膠分子聚合物中從負(fù)極向正級泳動并達(dá)到相互分離，且依次通過檢測窗口。第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理（二）熒光標(biāo)記DNA的檢測原理由激光器發(fā)出的極細(xì)光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)被向檢測區(qū)，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光DNA段，DNA片段上的熒光發(fā)色基團(tuán)吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長的熒光。第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理（二）熒光標(biāo)記DNA的檢測原理代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過光柵分光后再投射到CCD攝像機(jī)上同步成像。收集的熒光信號再傳輸給計(jì)算機(jī)加以處理。經(jīng)測序分析軟件對這些原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最后的測序結(jié)果以一種清晰直觀的圖形顯示出來。第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理單色熒光標(biāo)記法多色熒光標(biāo)記法熒光標(biāo)記引物法熒光標(biāo)記終止底物法熒光標(biāo)記引物法熒光標(biāo)記終止底物法（二）熒光標(biāo)記DNA的檢測原理熒光標(biāo)記DNA的檢測原理第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理定義將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的5’端，一組（4種）熒光標(biāo)記引物，其序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同。（1）多色熒光標(biāo)記法

--熒光標(biāo)記引物法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理反映過程測序反應(yīng)中，模板、反應(yīng)底物、DNA聚合酶及標(biāo)記引物等按A、T、C、G編號被置于4支微量離心管中。

A、T、C、G四個測序反應(yīng)分管進(jìn)行，上樣時合并在一個泳道內(nèi)電泳。特定顏色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對應(yīng)關(guān)系。（1）多色熒光標(biāo)記法

--熒光標(biāo)記引物法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理定義將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上。（2）多色熒光標(biāo)記法

--熒光標(biāo)記終止底物法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理反映過程反應(yīng)中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記。帶有熒光基團(tuán)的ddNTP在摻入DNA片段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時，也使該片段端標(biāo)上了一種特定的熒光染料。經(jīng)電泳后將各個熒光譜帶分開，根據(jù)熒光顏色的不同來判斷所代表的不同堿基信息。（2）多色熒光標(biāo)記法

--熒光標(biāo)記終止底物法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理AGCTGGTTAAC模板：TCCATGAT產(chǎn)物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACT（2）多色熒光標(biāo)記法

--熒光標(biāo)記終止底物法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理定義將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的5’端，一組（4種）熒光標(biāo)記引物，其序列相同，標(biāo)記的熒光染料是一種。（3）單色熒光標(biāo)記法方法分為熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法。第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理反映過程將A、C、G、T四個反應(yīng)分別在不同擴(kuò)增管中進(jìn)行。電泳時各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳。（3）單色熒光標(biāo)記法第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理單色熒光標(biāo)記法與多色熒光標(biāo)記法的不同點(diǎn)：

1.單色熒光標(biāo)記法需將A、C、G、T四個反應(yīng)分別在同擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時各管產(chǎn)物也分別在不同泳道中電泳。

2.多色熒光標(biāo)記引物法需將A、C、G、T四個反應(yīng)分在不同擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時可合并在同一泳道中電泳。

3.多色熒光標(biāo)記終止底物法可將A、C、G、T四個反在同一擴(kuò)增管中進(jìn)行，電泳時在同一泳道中電泳。第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理測序分析凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理測序結(jié)果第四節(jié)全自動DNA測序儀一、全自動DNA測序儀的工作原理全自動DNA測序儀

平板型電泳毛細(xì)管電泳第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)平板式電泳毛細(xì)管電泳凝膠灌制在兩塊玻璃板中間，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，又稱超薄片層凝膠電泳。將凝膠高分子聚合物灌制于毛細(xì)管中（內(nèi)徑50

m～100

m），在高壓及較低濃度膠的條件下實(shí)現(xiàn)DNA片段的快速分離。第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)主機(jī)應(yīng)用軟件微型計(jì)算機(jī)第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)功能區(qū)電泳系統(tǒng)、激光器和熒光檢測系統(tǒng)自動進(jìn)樣器區(qū)、電泳分離塊區(qū)、檢測區(qū)（一）主機(jī)第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)自動進(jìn)樣器區(qū)檢測區(qū)

凝膠塊區(qū)

第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)CEQ8000DNA測序儀結(jié)構(gòu)示意圖

第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)ABI3730XL型全自動DNA測序儀結(jié)構(gòu)第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)應(yīng)用軟件包括數(shù)據(jù)收集軟件、DNA序列分析軟件及DNA片段大小和定量分析軟件。（二）應(yīng)用軟件第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)控制主機(jī)運(yùn)行，對來自主機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析。設(shè)置測序條件（樣品進(jìn)樣量、電泳的溫度、時間、電壓等），同步監(jiān)測電泳情況并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。（三）計(jì)算機(jī)第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)部分全自動DNA測序儀:第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)第四節(jié)全自動DNA測序儀二、全自動DNA測序儀的基本結(jié)構(gòu)（一）毛細(xì)管電泳型DNA

測序儀常見故障

電泳時儀器顯示無電流電極彎曲電泳時產(chǎn)生電弧其它第四節(jié)全自動DNA測序儀三、全自動DNA測序儀的維護(hù)與常見故障處理1.電泳時儀器顯示無電流電泳緩沖液蒸發(fā)使液面降低，而未能接觸到毛細(xì)管電極彎曲而無法浸入緩沖液中毛細(xì)管未浸入緩沖液中毛細(xì)管內(nèi)有氣泡等

第四節(jié)全自動DNA測序儀三、全自動DNA測序儀的維護(hù)與常見故障處理2.電極彎曲安裝、調(diào)整或清洗電極后未進(jìn)行電極定標(biāo)操作就直接執(zhí)行電泳命令，電極不能準(zhǔn)確插入各管中運(yùn)行前未將樣品盤歸位、或雖然執(zhí)行了歸位操作，但X/Y軸歸位尚未結(jié)束就運(yùn)行Z軸歸位等第四節(jié)全自動DNA測序儀三、全自動DNA測序儀的維護(hù)與常見故障處理3.電泳時產(chǎn)生電弧主要原因是電極、加熱板或自動進(jìn)樣器上有灰塵沉積其它測序結(jié)束后應(yīng)將毛細(xì)管負(fù)極端浸在蒸餾水中，避免凝膠干燥而阻塞毛細(xì)管定期清洗泵塊定期更換電極緩沖液、洗滌液和廢液管

第四節(jié)全自動DNA測序儀三、全自動DNA測序儀的維護(hù)與常見故障處理（二）平板電泳型DNA

測序儀常見故障電泳時儀器顯示無電流