高三二輪復(fù)習(xí)生物【知識精研】《引物的設(shè)計與應(yīng)用》專題課件

一、引物的概念2017年，研究者利用現(xiàn)代人的DNA做了一個“魚餌”一般的引子，由于相似度高，這個引子會把所提取的DNA混合溶液里屬于古代人類本身的DNA吸附并釣取出來?！耙印笔鞘裁?？怎么設(shè)計？引物的設(shè)計與應(yīng)用一、引物的概念多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。體內(nèi)DNA的復(fù)制時，引物酶將引物添加到子鏈的5’端。5′5′5′5′5′5′5′3′5′5′5′5′3′3′3′3′3′3′3′3′5′3′引物體內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)（體外）引物的實質(zhì)一小段單鏈RNA一般用一小段單鏈____引物與DNA模板鏈的關(guān)系DNA復(fù)制時，DNA的_____條鏈作為模板，依據(jù)_____________原則，與目的基因的脫氧核苷酸序列配對引物的功能DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從已有片段的____端延伸DNA鏈延伸方向從____端向____端延伸DNA2堿基互補配對3’5’3’一、引物的概念1.比較體內(nèi)與體外的引物2：找出幾個關(guān)鍵詞，嘗試概括引物是什么？引物:_______________________________________。一段能與母鏈DNA堿基互補配對的短單鏈核酸二、引物的設(shè)計1.小組討論：人為設(shè)計引物應(yīng)該注意些什么？1._________________2._________________3._________________4._________________引物之間不會自身配對或者相互配對引物與目的基因兩端互補配對兩引物的CG含量相當(dāng)，復(fù)性溫度相差小引物的長度適宜（15-30bp)特異性高效性PCR過程中出現(xiàn)下列情況是由于引物設(shè)計中哪些問題造成的，請配對三、引物的應(yīng)用資料1：亨廷頓舞蹈癥（簡稱HD）是一種單基因的顯性遺傳病,由基因HTT的突變引起。HTT基因位于四號染色體,在其一號外顯子(exon1)區(qū)域有一段CAG重復(fù)序列。正常人群中這一重復(fù)序列的長度為6~35個重復(fù),如果擴增超過40個重復(fù)序列,則會導(dǎo)致發(fā)病,出現(xiàn)異常運動癥狀。HTTHtt1.亨廷頓舞蹈癥由哪一類可遺傳變異引起的疾??？能通過什么手段檢測？屬于基因突變引起的；需要通過基因檢測來判斷是否患病。5′CTTCGAAATTC——TCTCCCGATCGG——ATCCTTTGCTCT3′3′GAAGCTTTAAG——AGAGGGCTAGCC——TAGGAAACGAGA5′基因1基因2引物Ⅰ5′—CTTCGAAATTC—3′引物Ⅱ3′—AGAGGGCTAGCC—5′

3′—TAGGAAACGAGA—5′2.為了更好的檢測，醫(yī)生在提取小紅的DNA后首先進行了PCR擴增，如果基因1是目的基因，應(yīng)該選擇哪一對引物進行擴增？如果要擴增基因2呢？5′—TCTCCCGATCGG—3′三、引物的應(yīng)用引物Ⅲ引物Ⅳ5′CTTCGAAATTC——TCTCCCGATCGG——ATCCTTTGCTCT3′3′GAAGCTTTAAG——AGAGGGCTAGCC——TAGGAAACGAGA5′基因1基因2三、引物的應(yīng)用引物Ⅰ5′—CTTCGAAATTC—3′3.根據(jù)引物設(shè)計的原則，這四個引物能夠同時在一個PCR體系下使用嗎？引物Ⅱ3′—AGAGGGCTAGCC—5′

引物Ⅳ5′—TCTCCCGATCGG—3′引物Ⅲ3′—TAGGAAACGAGA—5′

三、引物的應(yīng)用資料2：隨著對突變的亨廷頓蛋白如何導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的理解日益增多,可開發(fā)的合理治療靶點也變得豐富。最近發(fā)展的另一種靶向HTTDNA的技術(shù)則使用了失活的鋅指核酸剪切酶(ZFN)結(jié)合至HTT啟動子區(qū)域,達到抑制HTT基因表達的效果，科學(xué)家想獲得完整的非編碼區(qū)序列來研究。HTT基因編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子HTT基因編碼區(qū)啟動子終止子三、引物的應(yīng)用2.擴增兩側(cè)非編碼區(qū)需要設(shè)計幾個引物？請在圖上標(biāo)注。3.已知HTT基因編碼區(qū)序列，能夠設(shè)計出幾個引物？能擴增出完整的非編碼區(qū)嗎？5'5'3'3'？？1.閱讀資料2并圈出關(guān)鍵詞，想一想科學(xué)家為什么想獲得非編碼區(qū)序列？非編碼區(qū)序列包含啟動子和終止子，可以通過對非編碼區(qū)的修飾，抑制轉(zhuǎn)錄形成mRNA。需要4個引物只能設(shè)計出兩個，不能擴增完整的非編碼區(qū)。引物2引物1引物3引物4三、引物的應(yīng)用5.HTT基因上有多個限制酶切位點（如表），可以實現(xiàn)DNA片段的環(huán)化，應(yīng)當(dāng)選擇____________酶進行酶切處理。選擇哪一對引物進行擴增？EcoRⅠBclⅠBamHⅠHindⅢ5'-G↓AATTC-3'5'-T↓GATCA-3'5'-G↓GATCC-3'5'-A↓AGCTT-3'BclⅠ和BamHⅠ4.為解決上述問題，科學(xué)家對DNA片段進行了如圖所示處理，這樣處理的有何作用？如何實現(xiàn)DNA片段的環(huán)化？引物1引物4引物2引物3BclⅠEcoRⅠHindⅢBamHⅠ三、引物的應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶切割該DNA酶切產(chǎn)物_____已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子已知序列為模板設(shè)計一對方向____的特異性引物擴增出未知序列環(huán)化相反四、總結(jié)堿基互補配對核酸特異高效擴增目的基因擴增目的基因兩側(cè)未知序列PCR擴增時，加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當(dāng)探針完整時，R發(fā)出的熒光信號被Q吸收而不發(fā)熒光。在PCR擴增過程中，當(dāng)Taq酶遇到探針時會使探針?biāo)舛尫懦鲇坞x的R和Q,R發(fā)出的熒光信號被相應(yīng)儀器檢測到。核酸檢測我國科學(xué)家領(lǐng)銜的團隊利用CRISPR/Cas9等技術(shù)，將的人亨廷頓舞蹈病致病基因（HTT基因）第1外顯子“敲入”豬基因組內(nèi)，獲得了人—豬“鑲嵌”HTT基因，利用胚胎工程技術(shù)成功地構(gòu)建了亨廷頓舞蹈病的動物模型。基因編輯分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。四、拓展延伸有科學(xué)家想用CAA替換HTT基因CAG重復(fù)序列，（圖中重疊延伸PCR過程中，引物a、b用來擴增含有突變位點的上游DNA序列，引物c、d用來擴增含突變位點的下游DNA序列)。具體的步驟如下：HTTHTT(1)研究發(fā)現(xiàn)，亨廷頓舞蹈病患者編碼亨廷頓蛋白出現(xiàn)異常增多的谷氨酰胺（可能用到的密碼子：GAC：天冬氨酸，CAG：谷氨酰胺，GUC：纈氨酸，CUG：亮氨酸），圖中HTT基因的上鏈的堿基序列是CAG，則mRNA是以_______（上/下）鏈作為模板鏈的。重疊延伸PCR示意圖中的黑點表示突變部位的堿基，引物b中該部位的堿基是_______，引物C中該部位的堿基是_______。下TA四、拓展延伸有科學(xué)家想用CAA替換HTT基因CAG重復(fù)序列，（圖中重疊延伸PCR過程中，引物a、b用來