儀器分析實驗講義2011.11

PAGEPAGE13目錄實驗一取代基電效應對芳烴吸收帶的影響及導數(shù)光譜的測繪實驗二紫外分光光度法測定苯甲酸鈉的含量（標準曲線法）實驗三柱色譜法測定氧化鋁的活度實驗四紙色譜法分離分析有機酸實驗五薄層色譜法分離分析混合染料實驗六高效液相色譜定性分析實驗七氣相色譜法定性分析實驗八高效液相色譜法定量分析（外標法一點法）實驗九固體樣品紅外透射光譜的測定實驗十氣相色譜法測定乙酸乙酯中苯的含量（內(nèi)標兩點法）實驗一取代基電效應對芳烴吸收帶的影響一、目的要求通過測定幾種典型的發(fā)色基團取代苯和助色基團取代苯的E2吸收帶及B吸收帶，掌握取代基的共軛效應和誘導效應對吸收帶波長影響的規(guī)律，及它們在結(jié)構(gòu)分析中的應用。二、原理取代基對芳烴吸收帶的影響與取代基結(jié)構(gòu)、取代基個數(shù)、位置有關(guān)。研究取代基對芳烴吸收帶的影響規(guī)律，對確定有機化合物結(jié)構(gòu)具有重要的作用。對于發(fā)色團取代的苯，由于含有鍵的發(fā)色團(、、等)與苯相連時，共軛，產(chǎn)生更大的共軛體系，E2帶(＞104)紅移，在200～250nm范圍出現(xiàn)；同時B吸收帶也產(chǎn)生較大紅移。若取代基是含有n電子的發(fā)色團，分子除了可以發(fā)生躍遷之外，還可能發(fā)生躍遷，譜圖中還會出現(xiàn)低強度的R吸收帶。對于助色團取代苯，由于含有未成鍵電子對的助色團(-OH,-OR,-NH2,-NR2，-X等)與苯相連時，產(chǎn)生共軛，使E2帶、B帶均紅移；B帶吸收強度增大，精細結(jié)構(gòu)消失。三、儀器與試劑（1）儀器：紫外分光光度計。（2）試劑：濃度為5.0×10-3mol/L的苯/乙醇溶液；6.0×10-5mol/L的苯甲酸/乙醇溶液；5.0×10-4mol/L的苯胺/乙醇溶液；1mol/L的HCl/乙醇溶液；無水乙醇。四、實驗步驟1．用1cm吸收池，以無水乙醇為參比，分別測定苯、苯甲酸、苯胺的乙醇溶液在波長200~340nm區(qū)域內(nèi)的紫外吸收光譜。2．用1cm吸收池，以無水乙醇為參比，測定苯胺的紫外吸收光譜，在苯胺中加入1滴1mol/LHCl/乙醇溶液，再次測定紫外吸收光譜，進行比較。五、數(shù)據(jù)處理1．分別測定苯、苯甲酸的E2吸收帶的、，同時觀察B吸收帶的位置，比較發(fā)色團對芳烴吸收帶的影響。2．比較苯胺與苯胺鹽B吸收帶波長與強度的變化。3．根據(jù)取代基電效應對以上實驗結(jié)果作出正確的解釋。六、問題討論1．對上述實驗中所列的化合物，如果采用不同極性的溶劑進行測定，吸收帶將會有什么變化？2．從苯胺及其鹽的紫外吸收帶的變化，給你什么啟示？有何實際應用價值？實驗二紫外分光光度法測定苯甲酸鈉的含量（標準曲線法）一、目的1．掌握紫外分光光度計定量操作方法。2．掌握標準曲線法定量計算方法。二、提要標準曲線法定量分析，即用已知量的標準物質(zhì)，配制一系列濃度的標準溶液，在相同的條件下進行測定，以儀器的響應值（UV-Vis法中為吸光度A）為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線。利用此曲線或它的回歸方程，可以計算樣品溶液中該組分的含量。式中a與b分別為標準曲線的截距與斜率。苯甲酸鈉的紫外吸收光譜在229nm處有最大吸收。制備系列濃度的苯甲酸鈉標準溶液，以229nm為檢測波長，測定其吸光度，計算回歸方程；可測定苯甲酸鈉樣品溶液中苯甲酸鈉的含量。三、儀器與試劑紫外分光光度計；苯甲酸鈉/0.04MHCl儲備液（100μg/ml）；0.04mol/LHCl水溶液；樣品溶液三、方法1檢測波長的選擇以0.04mol/LHCl溶液為參比溶液，于紫外－可見分光光度計上測定苯甲酸鈉標準溶液的吸收光譜（200~320nm），確定苯甲酸鈉含量測定的測定波長（λ229nm）。2苯甲酸鈉標準曲線的繪制配制濃度為2、4、6、8、10μg/ml苯甲酸鈉/0.04MHCl溶液。以0.04mol/LHCl溶液為參比溶液，測定系列濃度的苯甲酸鈉/0.04MHCl溶液在229nm處的吸光度，計算其回歸方程。3測定以0.04mol/LHCl溶液為參比溶液，測定樣品溶液的吸光度值(n=3)，根據(jù)回歸方程計算樣品溶液中苯甲酸鈉的含量（，RSD%）。四、思考題1．制備標準曲線的目的是什么？2．為什么要用/0.04MHCl溶液為參比溶液進行測定？實驗三柱色譜法測定氧化鋁的活度一、目的熟悉用柱色譜測定氧化鋁活度的方法；了解吸附柱層析的一般操作方法。二、提要1．氧化鋁的吸附能力等級測定方法較常用的為Brockmann法，觀察對多種偶氮染料的吸附情況衡量氧化鋁的活度。所采用的染料按吸附性（極性）遞增的排列順序為：偶氮苯（1號）<對甲氧基偶氮苯（2號）<蘇丹黃（3號）<蘇丹紅（4號）<對氨基偶氮苯（5號）<對羥基偶氮苯（6號）。2．根據(jù)上述染料的吸附情況，可將氧化鋁的活度分為五級，吸附性能越小，活度級別越大。三、儀器與試劑（1）色譜柱（長10cm，內(nèi)徑1.5cm）1根；帶橡皮套的玻璃棒1根；小漏斗1個；10ml量筒2個；精致棉及圓形濾紙若干；（2）六種染料溶液：偶氮苯、對甲氧基偶氮苯、蘇丹紅、對氨基偶氮苯、對羥基偶氮苯各20mg，分別溶于10ml純的無水苯中，加入適量石油醚定容至50ml；（3）苯和石油醚混和液（1:4）；（4）氧化鋁（活度待測）。活度級別染料位置=1\*ROMANI=2\*ROMANII=3\*ROMANIII=4\*ROMANIV=5\*ROMANV柱上層柱下層流出液21321432543654四、實驗步驟1．色譜柱的制備準備1根潔凈干燥的色譜管，于管底墊一層精制棉（不要太緊），垂直夾在滴定臺上，然后稱取8g待測氧化鋁，通過一干燥小漏斗，仔細裝入色譜管中，用一帶橡皮套的玻璃棒輕輕地均勻地敲打至氧化鋁至高度約5cm處，然后在其表面覆一層圓形濾紙。2．氧化鋁活度的測定①量取1、2號染料溶液各5ml（預先混勻），加入色譜柱中，待溶液全部通過后，立即以苯和石油醚混和液（1:4）20ml淋洗色譜柱，控制流速為20~30滴/min。②觀察和記錄色譜柱中染料的顏色和位置，判斷氧化鋁的活度級別。五、注意事項1．用于配制染料溶液的石油醚及苯必須是無水的。2．精制棉用量要少，要平整，但不要塞得太緊，以免流速過慢。3．色譜柱必須具有均勻的緊密度，表面應力求水平，染料溶液應小心地加入，勿使氧化鋁表面受到擾動。4．倒入染料時，注意先把活塞打開，以利于空氣排出。5．流出液用小燒杯收集，倒入回收瓶中。6．整個實驗必須無水操作。六、思考題1．根據(jù)各染料的結(jié)構(gòu)，說明極性遞增和遞減的順序。2．如果加入2號、3號染料，色譜管流出液為無色，柱下層為淡黃色，柱上層為橙黃色，此氧化鋁為幾級？注：定級所用的染料編號、名稱、結(jié)構(gòu)及其溶液顏色如下：1號偶氮苯淡黃色2號對甲氧基偶氮苯黃色3號蘇丹黃橙色4號蘇丹紅紫紅色5號對氨基偶氮苯黃色6號對羥基偶氮苯黃色實驗四紙色譜法分離分析有機酸一、目的１．掌握紙色譜的操作方法。２．了解紙色譜法在分離鑒定方面的應用。二、提要酒石酸和羥乙酸由于結(jié)構(gòu)上差異，可用紙色譜法分離鑒定。展開劑用正丁醇－醋酸－水（12:3:5），顯色劑用0.04％溴酚藍/乙醇溶液。三、儀器與試劑（1）色譜筒（高22cm，內(nèi)徑5.5cm）1只；培養(yǎng)皿（Ф12cm）；三角噴瓶1只；點樣毛細管；色譜濾紙若干；電吹風1只；（2）有機酸：2％酒石酸、2％羥乙酸、混和酸（酒石酸、羥乙酸2％），均為乙醇溶液；顯色劑：0.04％溴酚藍的乙醇溶液。（3）展開劑：正丁醇－醋酸－水（12:3:5）四、操作步驟1．條形（1）點樣：取色譜濾紙（3.5cm×15cm）一條，在距紙的一端2~3cm處，用鉛筆畫一橫線作為起始線，距離起始線6cm處劃一橫線。在起始線分別點樣（酒石酸、羥乙酸、混和酸），點間距離約為1.2cm。待干后，再點第二次，一般每個樣點2次即可，點的直徑約為0.2~0.3cm。（2）展開：在色譜筒中放入展開劑20ml，將點好的色譜紙懸空吊在密閉色譜筒的掛鉤上，飽和10min。再小心將掛鉤往下推動，直至點有樣品的一端浸入展開劑中約0.5cm處，展開。待展距（展開劑前沿離起始線）6cm左右時取出（大約80min），立即用鉛筆劃下溶劑前沿，并用電吹風吹干，直至無酸味（可用熱風吹5min左右）。（3）顯色：在色譜紙上噴以顯色劑―0.04％溴酚藍的乙醇溶液，用鉛筆標出斑點的位置，并記錄斑點的顏色。（4）定性：分別測量Rf值，并進行對照。2．圓形（1）點樣：剪一比培養(yǎng)皿直徑大0.5cm的圓形色譜濾紙，在中心劃一十字，在距十字中心1.0cm處分別做一標記，每一標記處點一種樣品，一般點樣2次（點樣方法同上）。（2）展開：在培養(yǎng)皿內(nèi)放入展開劑10ml，卷一紙芯插在圓形色譜濾紙中間（十字中心），并將紙芯垂直浸入展開劑中展開。待展開劑前沿離原點4~4.5cm時取出（大約50~60min），立即劃下溶劑前沿，并用電吹風吹干，直至無酸味（可用熱風吹5min左右）。（3）顯色：同上。（4）定性：同上。五、注意事項1．色譜紙要平整，不得沾污，點樣時可在下面墊一白紙。2．條形色譜紙要掛垂直；圓形色譜紙要放水平，紙芯要放垂直。3．顯色前必須把整張色譜吹干，直到無酸味為止。4．鉛筆、直尺自備。不準用鋼筆或圓珠筆在色譜紙上做記號。六、思考題1．根據(jù)酒石酸和羥乙酸的結(jié)構(gòu)，推測哪個Rf值大，哪個Rf值小，為什么？2．影響紙色譜Rf值的因素有哪些？3．顯色前為什么一定要把色譜紙吹至無酸味？4．色譜筒和色譜紙為什么要用展開劑飽和？實驗五薄層色譜法分離分析混合染料一、目的掌握薄層硬板的制備方法；熟悉薄層色譜一般操作；掌握薄層色譜定性方法。二、儀器與試劑（1）儀器：層析槽、玻璃板、毛細管、量筒、臺秤；（2）硅膠G、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na0.5％）、苯；（3）3.0mg/ml對羥基偶氮苯=1\*GB3①，3.0mg/ml對氨基偶氮苯=2\*GB3②，2.0mg/ml二甲黃=3\*GB3③，1.5mg/ml蘇丹Ⅲ=4\*GB3④；（4）混和染料=5\*GB3⑤。三、提要1．TLC一般操作樣品溶劑顯色劑純制制板→→→點樣→→→展開→→→檢出→→→定量2．定性：比較組分的Rf、Rst及斑點的顏色。3．分離效率評價：計算相鄰斑點的分離度。L:斑點與原點之間的距離W：斑點的直徑4．定量：薄層掃描法四、方法1．制板：稱取硅膠4g于研缽中，加CMC-Na溶液10ml，研磨成均勻的糊狀，倒在清潔的玻璃板上，用玻棒使其分布開（留有一空白處便于拿取薄板），輕輕晃動或搖動玻板，使成一均勻平坦的薄層，放在水平面上涼干。薄層板的活化：在110℃2．點樣：取薄層板，在距一端2.5cm處，用鉛筆輕輕畫出一條直線作為起始線，離起始線10cm處再畫一直線作為前沿線，用毛細管分別吸取染料=1\*GB3①、=2\*GB3②、=3\*GB3③、=4\*GB3④及混和染料=5\*GB3⑤分別點樣1~2下。3．展開：將層析槽邊緣上一層凡士林，將上蓋合上拉磨數(shù)次；加入10ml苯于層析槽中，將層析槽一端墊高，將玻璃支架放在低端，并將薄層放入槽內(nèi)的玻璃支架上（注意：薄層板不能浸入苯中）飽和10min后，展開10cm，取出。4．檢出（定位）：有色染料=1\*GB3①、=2\*GB3②、=3\*GB3③、=4\*GB3④在薄層板上的分離情況無需特殊處理就一目了然。分別計算它們的Rf值。以染料=3\*GB3③為參比物，分別計算=1\*GB3①、=2\*GB3②、=4\*GB3④染料的Rst值。鑒定混合染料的組成。五、注意事項：1．點樣原點直徑控制在2~3mm之間。2．展開時層析槽要放平坦。3．展開劑中含水量的多少影響分離，故用干燥的儀器。4．展開前，層析槽內(nèi)先用蒸氣飽和，組分的Rf值易于重現(xiàn)。5．苯有毒，使用時注意防止污染環(huán)境。實驗六高效液相色譜定性分析一、目的1．掌握高效液相色譜儀的使用方法。2．掌握在反相高效液相色譜分離過程中，當流動相比例發(fā)生變化時，組分保留時間及分離度的變化。3．學會高效液相色譜的定性方法。二、提要本實驗是采用反相高效液相色譜法對已知組成的樣品進行分離。在反相色譜中，固定相的極性小于流動相，流動相中水的比例越大，流動相的洗脫強度越?。唤M分的極性越小，在色譜柱上的保留能力越強。三、實驗條件1．高效液相色譜儀；2．C18反相鍵合硅膠填充柱（4.6mm×250mm,5μm）；3．流動相：甲醇－水。流速：1ml/min。4．檢測器：紫外檢測器，檢測波長254nm；5．對照品溶液：萘的甲醇溶液；樣品溶液：苯、甲苯、萘、蒽的甲醇溶液。四、操作步驟1．將高壓泵啟動，調(diào)節(jié)流速1.0ml/min，流動相組成為甲醇—水（95:5），平衡色譜柱約10分鐘。2．吸取樣品溶液，進樣，記錄色譜圖，并打印出各色譜峰的保留時間。3．改變流動相比例為甲醇—水（85:15），平衡色譜柱約10分鐘，取樣品溶液，進樣，記錄色譜圖。4．在相同色譜條件下，取萘的對照品溶液進樣，通過保留時間對照，對混合樣品中的色譜峰進行定性。5.分析實驗結(jié)果，觀察流動相的改變對各組分保留時間及分離度的影響。五、思考題1．利用高效液相色譜儀定性的方法有幾種？分別在什么情況下適用？2.根據(jù)樣品中各組分的性質(zhì)（極性大?。?，分析各組分的出峰順序，找出樣品中各色譜峰的歸屬。2．本實驗的色譜原理屬于哪一類？實驗七氣相色譜法定性分析一、目的１．練習氣相色譜儀的使用，了解氣相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)。２．掌握柱溫的變化對組分保留時間及分離度的影響。３．學會氣相色譜定性分析，掌握通過已知物保留值對比進行定性分析的方法。二、提要氣相色譜是一種強有力的分離手段，實際工作中，有時遇到的樣品其成分大體上是已知的，這時得到的氣相色譜圖可以借助純的標樣加以對照，利用保留值進行定性，這樣的定性鑒定是相當簡單的。當干擾組分與待測組分tR接近時，可采用峰高增加法定性：首先將樣品進樣，測定待測組分的峰面積；然后在樣品中加入對照品，在相同的色譜條件下進樣分析，如果待測組分的峰面積增加，且峰型對稱，則為同一個組分；如果待測組分峰面積增加，但峰變形（加寬），或出現(xiàn)新的色譜峰，則不是同一個組分。三、儀器與試劑（1）氣相色譜儀（FID檢測器）；（2）微量注射器（1μl）；（3）標樣：甲苯；（4）樣品：苯、甲苯、乙酸乙酯、乙腈混合樣品。四、操作步驟１．設置實驗條件：色譜柱：甲基交聯(lián)硅烷柱(25m×0.32mm,0.52μm)；溫度：柱溫35℃、80℃，檢測室250℃，氣化室250℃；載氣N2；流量：1.2ml/min；分流比1:90。2．設定柱溫為150℃，待儀器穩(wěn)定后，注射0.2μl混合樣品，記錄色譜圖及各組分的保留3．設定柱溫80℃，待儀器穩(wěn)定后，分別注射0.2μl混合樣品和甲苯標樣，記錄色譜圖及各組分的保留時間；通過保留時間對照，對混合樣品中的組分進行定性分析4．將不同溫度各組分的保留時間列成表格，確定混合物中各峰為何物，并討論柱溫的改變對組分保留時間及分離度的影響。五、注意事項１．實驗前，對色譜儀整個氣路系統(tǒng)必須進行檢漏。如有漏氣點，應進行排除。２．微量注射器應小心使用，用力不可過猛，芯子不要折彎，也不要全部拉出套外。若有不清楚之處，應立即報告指導老師妥善處理，樣品溶液中如有難揮發(fā)溶質(zhì)，使用完畢立即用乙醇或丙酮多次清洗，以免芯子受污而卡死。六、思考題1．保留時間、調(diào)整保留時間和相對保留值如何定義？他們各自的特點和適用范圍如何？2．根據(jù)色譜原理，試推測在實驗中苯、甲苯、乙酸乙酯、乙腈出峰先后順序。3．氣相色譜法定性的原理是什么？實驗八高效液相色譜法定量分析（外標一點法）一、目的練習高效液相色譜儀的使用。二、提要外標法可分為外標一點法、外標二點法及標準曲線法。當標準曲線截距為零時，可用外標一點法定量。在藥物分析中，為了減小實驗條件波動對分析結(jié)果的影響，采用隨行外標一點法，即每次測定都平行測定對照品與樣品溶液。三、儀器與試劑1．高效液相色譜儀；2．ODS柱（4.6mm×150mm，5μm）；3．甲醇（色譜純）；純凈水；4．檢測器：紫外檢測器，檢測波長254nm；色譜工作站。5．混合樣品；6.萘對照品（40μg/ml）四、操作步驟1．色譜條件C18反相鍵合硅膠填充柱；流動相：甲醇：水（85：15）；檢測波長：254nm；流速：1ml/min。2．平衡色譜柱，分別吸取對照品溶液與供試品溶液，進樣20μl，測定萘的色譜峰面積，并計算混合溶液中萘的含量。五、思考題1．外標一點法主要誤差來源是什么？2．紫外檢測器的優(yōu)缺點分別是什么？實驗九固體樣品紅外透射光譜的測定一、目的掌握固體樣品的常規(guī)制樣方法。了解紅外光譜儀的工作原理及一般操作使用。對測定物質(zhì)的紅外光譜圖進行解析。二、提要不同的樣品狀態(tài)(固體、液體、氣體及粘稠樣品)需要相應的制樣方法。制樣方法的選擇和制樣技術(shù)的好壞直接影響譜帶的頻率、數(shù)目和強度。（1）液膜法：樣品的沸點高于100℃可采用液膜法測定。黏稠的樣品也采用液膜法。這種方法較簡單，只要在兩個鹽片之間，滴加1~2滴未知樣品，使之形成一層薄的液膜。（2）液池法：樣品的沸點低于100℃可采用液池法。選擇不同的墊片尺寸可調(diào)節(jié)液池的厚度，對強吸收的樣品用溶劑稀釋后再測定。（3）糊狀法：需準確知道樣品是否含－OH基團(避免KBr中水的影響)時采用糊狀法。這種方法是將干燥的粉末研細，然后加入幾滴懸浮劑在瑪瑙研缽中研磨成均勻的糊狀，涂在鹽片上測定。常用的懸浮劑有石蠟油和氟化煤油。（4）壓片法：粉末樣品常用壓片法。將研細的粉末分散在固體介質(zhì)中，并用壓片裝置壓成透明的薄片后測定。固體分散截至一般是金屬氯化物(如KBr)，使用時要將其充分研細，顆粒直徑最好小于2μm(因為中紅外區(qū)的波長是從2.5μm開始的)。（5）薄膜法：對于熔點低，熔融時不發(fā)生分解、升華和其他化學變化的物質(zhì)，可采用加熱熔融的方法壓制成薄膜后測定。三、儀器與試劑付利葉變換紅外光譜儀；壓片機、模具、樣品架；瑪瑙研缽、鋼鏟、鑷子、紅外燈；KBr(光譜純或分析純)、苯甲酸。四、實驗內(nèi)容與步驟取2~3mg苯甲