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微生物及無菌知識(shí)培訓(xùn)一、前言我們所生活的環(huán)境中,到處都存在著大量的微生物。在一般空氣中,微生物達(dá)800~3500個(gè)/m3,在土壤中達(dá)1~500*108個(gè)/g,在嚴(yán)重污染的水中可達(dá)107個(gè)/mL。(飲用水要求細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/mL,大腸桿菌≤3個(gè)/mL。經(jīng)水塔或貯水池貯存后,短期內(nèi)可繁殖至105~106個(gè)/ml。)人的頭皮上有140萬個(gè)/cm2,兩手上約有4~40萬個(gè),1g指甲污垢38億個(gè),1g糞便可達(dá)10~1000億個(gè)??梢哉f微生物是無處不在,無處不有。許多以前被人們認(rèn)為是極端(高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、低溫等)甚至是致死的環(huán)境,現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)生活著各種類型的微生物(稱為極端微生物)。事實(shí)說明,微生物有特別頑強(qiáng)的生存、繁殖和變異能力來適應(yīng)環(huán)境。微生物種類繁多,有的對(duì)人有益,有的有害,有的無益也無害。但在藥品生產(chǎn)過程中,不可能對(duì)環(huán)境中的各種微生物加以區(qū)別對(duì)待,為保證食品的安全有效,需要對(duì)其進(jìn)行控制。空氣中的微生物多數(shù)附著在灰塵上,或以芽孢形式懸浮于空氣中,1μm以下者處于懸浮狀態(tài),10μm以上者會(huì)逐漸沉下來而形成菌塵。所以也要對(duì)塵粒進(jìn)行控制。人是潔凈室最大的污染源,占90%左右。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個(gè)以上的含菌粒子,女性為750個(gè)以上。穿無菌服時(shí),靜止時(shí)的發(fā)菌量為10~300個(gè)/min,一般活動(dòng)時(shí)發(fā)菌量為150~1000個(gè)/min,行走時(shí)發(fā)菌量為900~2500個(gè)/min??人砸淮伟l(fā)菌量為70~700個(gè)/min,噴嚏一次為4000~60000個(gè)/min。所以在潔凈室中,人的數(shù)量和活動(dòng)應(yīng)有特別嚴(yán)格的限制。二、微生物簡(jiǎn)介微生物在自然界中的分布極為廣泛,空氣、土壤、江河、湖泊、海洋等都有數(shù)量不等、種類不一的微生物存在。在人類、動(dòng)物和植物的體表及其與外界相通的腔道中也有多種微生物存在。絕大多數(shù)微生物對(duì)人類和動(dòng)、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多種元素循環(huán)靠微生物的代謝活動(dòng)來進(jìn)行。例如空氣中的大量氮?dú)庵挥幸揽课⑸锏淖饔貌拍鼙恢参镂?,土壤中的微生物能將?dòng)、植物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為無機(jī)含氮化合物,以供植物生長(zhǎng)的需要,而植物又為人類和動(dòng)物所利用。因此,沒有微生物,植物就不能新陳代謝,而人類和動(dòng)物也將無法生存。另一方面,中極少數(shù)微生物引起的傳染病發(fā)病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣,嚴(yán)重危害著人民健康。微生物是廣泛存在于自然界的一群體形微小(直徑小于1mm)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、肉眼看不見,必須借助光學(xué)或電子顯微鏡放大數(shù)百至數(shù)萬倍才能觀察到的生物。需要說明的是,微生物是一個(gè)比較籠統(tǒng)的概念,界線有時(shí)非常模糊。如單細(xì)胞藻類和一些原生動(dòng)物也應(yīng)算是微生物,但通常它們并不放在微生物中進(jìn)行研究。微生物具有以下特點(diǎn):①體積小,面積大;②吸收多,轉(zhuǎn)化快(2000倍體重/h);③生長(zhǎng)旺,繁殖快(20min分裂一次);④易變異,適應(yīng)強(qiáng);⑤分布廣,種類多(10萬種以上)。微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等差異可分成三大類:1.真核細(xì)胞型細(xì)胞核的分化程度較高,有核膜、核仁和染色體;胞質(zhì)內(nèi)有完整的細(xì)胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及線粒體等)。真菌屬于此類型微生物。2.原核細(xì)胞型
細(xì)胞核分化程度低,僅有原始核質(zhì),沒有核膜與核仁:細(xì)胞器不很完善。這類微生物種類眾多,有細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體和放線菌。3.非細(xì)胞型沒有典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu),亦無產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng),只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。體積微小,能通過除菌濾器。病毒屬于此類型微生物。三、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)1.細(xì)菌(原核單細(xì)胞生物)細(xì)菌按形狀可分為:球菌(0.5~2μm)、桿菌(長(zhǎng)1~5μm,寬0.3~1μm)和螺形菌(大小與桿菌相似)。按革蘭氏染色法染色的不同,分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁表面含較多的磷壁酸,會(huì)產(chǎn)生外毒素,如金黃色葡萄球菌;革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖,會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素(即熱原),如大腸桿菌。細(xì)菌一般有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核,有的還有莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結(jié)構(gòu)。細(xì)菌一般為無性繁殖,以二分法繁殖,兒十分鐘或1~2小時(shí)分裂次。資料:關(guān)于芽孢在溫度逐漸降低或營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí),芽胞桿菌屬(如炭疽桿菌)及梭狀芽胞桿菌屬(如破傷風(fēng)桿菌)能在菌體內(nèi)形成一個(gè)折光性很強(qiáng)的不易著色小體,稱為芽胞,芽胞是處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌,并非細(xì)菌的繁殖體,當(dāng)環(huán)境適宜時(shí),可恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖。芽胞在自然界分布廣泛,要注意防止污染。芽胞的抵抗力強(qiáng),對(duì)熱力、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑等理化因素均有強(qiáng)大的抵抗力,用一般的方法不易將其條死。有的芽胞可耐100C沸水煮沸數(shù)小時(shí)。殺滅芽胞最可靠的方法是高壓蒸汽滅菌。當(dāng)進(jìn)行消毒滅菌時(shí)往往以芽胞是否被殺死作為判斷滅菌效果的指標(biāo)。2.霉菌(絲狀真菌的通稱,真核多細(xì)胞生物)
霉菌是真菌的一部分。在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成絨毛狀或棉絮狀的菌絲體的真菌統(tǒng)稱為霉菌。霉菌細(xì)胞呈狹長(zhǎng)的管狀,稱為菌絲,菌絲直徑比細(xì)菌、放線菌大,約2~10um。菌絲分枝連接,交錯(cuò)集合在一起的總體稱為菌絲體。霉菌大多數(shù)是多細(xì)胞微生物,菌絲細(xì)胞由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和各種細(xì)胞器組成。細(xì)胞壁很薄,往往在表面產(chǎn)生色素,使菌落出現(xiàn)各種顏色。霉菌靠孢子繁殖,有無性繁殖和有性繁殖兩種方式,以無性繁殖為主。有些真菌可用釀酒造醬,或用于發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素(如青霉素、頭孢菌素);少數(shù)真菌能引起各種真菌病。真菌產(chǎn)生的真菌毒素(如黃曲霉素)有毒。3.酵母菌(真核單細(xì)胞生物,屬真菌)酵母菌以單細(xì)胞存在,呈圓形、卵圓形和香腸形,比細(xì)菌天,細(xì)胞長(zhǎng)5~30um,寬1~5um。細(xì)胞結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和各種細(xì)胞器等。酵母菌的增殖分無性繁殖和有性繁殖兩個(gè)階段,有三種方式:芽殖、裂殖、孢子生殖。酵母菌是重要的工業(yè)微生物,用于釀酒,生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白、B族維生素、核酸、輔酶A、細(xì)胞色素C等。一般對(duì)人體無害。4.放線菌(原核單細(xì)胞生物)放線菌有生長(zhǎng)發(fā)育良好的菌絲體,呈分枝狀,菌絲寬為0.2~1.2um,革蘭氏陽性。其內(nèi)部構(gòu)造與細(xì)菌相似,無完整的細(xì)胞核。菌落常星幅射狀,因此稱放線菌。繁殖方式為無性孢子繁殖。最適pH6.7~7.5,溫度25~30°C。放線菌可用于生產(chǎn)抗生素、維生素和酶類,少數(shù)可引起人畜放線菌病。5.病毒病毒是一類體積十分微小,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,只含一種核酸(DNA或RNA),沒有產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng),只能在活細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。病毒在自然界分布非常廣泛,在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常見的致病微生物,人類傳染病中大約75%是由病毒引起的。病毒體主要由核酸和蛋白質(zhì)組成。病毒體積微小,最大直徑300nm(如牛痘病毒),最小直徑20nm(如口蹄疫病毒),絕大多數(shù)在150nm以下,能通過細(xì)菌濾器,用普通光學(xué)顯微鏡看不見,必須用電子顯微鏡放大數(shù)千至數(shù)萬倍才能看見。形態(tài)多呈球形,少數(shù)為桿狀或磚形。噬菌體(細(xì)菌病毒)有呈蝌蚪狀的。四、微生物的營(yíng)養(yǎng)1.水分:水占細(xì)胞漿的70%~90%,是細(xì)胞的重要組成成分。較普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為:只有在含水的環(huán)境中微生物才能存活。但也有人發(fā)現(xiàn)在無水碳?xì)浠衔镏形⑸锟砷L(zhǎng)期存活。2.碳源:碳源是構(gòu)成細(xì)胞的重要物質(zhì)。有些微生物的碳源必須來自有機(jī)碳化合物如糖、蛋白質(zhì)、脂肪、有機(jī)酸等(同時(shí)利用其化學(xué)能),屬異養(yǎng)型;有些微生物不需有機(jī)碳化合物,以CO2為碳源,屬自養(yǎng)型(分為光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型)。3.氮源:氮是組成蛋白質(zhì)和核酸的重要元素。4.無機(jī)鹽類:細(xì)菌所需無機(jī)鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鉆、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多,其他只需微量。5.生長(zhǎng)因子:生長(zhǎng)因子是某些微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需,而其自身又不能合成的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括維生素、嘌呤和嘧啶等。五、微生物生長(zhǎng)的影響因素1.營(yíng)養(yǎng)物:2.pH值:各種微生物都有其最適宜的pH值,大多數(shù)細(xì)菌最適pH6.8~7.4,但一般有較大的容忍度,在4~9也可存活和生長(zhǎng),少數(shù)細(xì)菌能在極端pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)。真菌適于pH值3~6的微酸性環(huán)境,但在2~10也可生長(zhǎng)。3.溫度:微生物適于生長(zhǎng)繁殖要有適宜的溫度,當(dāng)超過其最低或最高可耐受的溫度時(shí),即停止生長(zhǎng)或死亡。一般細(xì)菌最適溫度為30~40℃,真菌為20~30℃。4.氧氣:大多數(shù)細(xì)菌和所有霉菌都是需氧菌(在有氧環(huán)境中才能生長(zhǎng)),少數(shù)細(xì)菌是厭氧菌(在無氧環(huán)境中才能生長(zhǎng)),有些細(xì)菌和酵母菌是兼性需氧厭氧的,在有氧或無氧環(huán)境中都能生長(zhǎng)繁殖。5.滲透壓:微生物細(xì)胞膜和所有生物膜一樣是一種半透膜,可讓水自由通過,對(duì)溶質(zhì)則有選擇性。由于細(xì)胞壁的保護(hù),微生物能存活在低滲透壓的水中。而在高滲溶液(如高濃度的鹽溶液或糖溶液、40%甘油)中,細(xì)胞會(huì)脫水并停止生長(zhǎng)繁殖。但也有一些專性耐高鹽細(xì)菌只有在高鹽(10~15%)條件下才生長(zhǎng)。6.表面張力:表面活性劑可降低表面張力它是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的因素之一。很多革蘭氏陰性菌,特別是大腸菌群可很好地在表血活性劑包圍的介質(zhì)中生長(zhǎng),而大多數(shù)革蘭氏陽性菌在表面張力低時(shí)(0.05N/m)不能很好生長(zhǎng)。陽離子表面活性劑對(duì)很多有機(jī)體有毒性,陰離子表面活性劑毒性很小,非離子表面活性劑幾乎沒有毒性,并可成為某此微生物的營(yíng)養(yǎng)物。六、消毒與滅菌消毒和滅菌兩個(gè)詞在實(shí)際使用中常被混用,其實(shí)它們的含義是有所不同的。消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營(yíng)養(yǎng)體的方法,而滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物,使之呈無菌狀態(tài)。(一)消毒是指殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物,使之達(dá)到無害化的處理。根據(jù)有無已知的傳染源可分預(yù)防性消毒和疫源性消毒;根據(jù)消毒的時(shí)間可分為隨時(shí)消毒和終末消毒。(二)滅菌是指殺滅或清除傳播媒介上的所有微生物(包括芽胞),使之達(dá)到無菌程度。經(jīng)過滅菌的物品稱“無菌物品”。消毒與滅菌是兩個(gè)不同的要領(lǐng)。滅菌可包括消毒,而消毒卻不能代替滅菌。消毒通常用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)環(huán)境、人員手部等,滅菌通常用于檢測(cè)用具、檢測(cè)試劑等。
常用滅菌法1、干熱滅菌法常見的有火焰、燒灼、干烤和紅外線滅菌等。①火焰、燒灼:通常用于實(shí)驗(yàn)室無菌操作中金屬或其它耐火材料制成的器具的滅菌。②干烤和紅外線:利用干熱空氣或熱輻射進(jìn)行滅菌。一般135~145℃需3~5h,160~170℃需2h以上,170~180℃需1h以上,180~200℃需0.5~1h。除熱原則需250℃30min,或200℃45min,180℃2h??諝鈧鳠崧?,穿透力不強(qiáng),故干熱滅菌時(shí)間長(zhǎng)。干熱滅菌時(shí)烤箱內(nèi)裝入物品應(yīng)留有空隙,以利空氣流動(dòng),否則使箱內(nèi)溫度不均,部分物品滅菌不徹底。2、濕熱滅菌法
通過熱蒸汽或沸水使蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強(qiáng),滅菌效果較干熱好。①煮沸或流通蒸汽滅菌:常壓下沸水和蒸汽的溫度是100℃,般處理30~60min可殺死細(xì)菌繁殖體,但不能完全殺滅芽孢。此法適用于不能高壓蒸汽滅菌的物品。②低溫間隙滅菌(巴斯德滅菌法):將物品先用60~80℃加熱(或煮沸)1h,然后置20~25℃保存24h(或常溫過夜),使其中殘存的芽孢萌發(fā)成繁殖體,再用以上條件滅菌,如此反復(fù)三次。本法適用于不耐高溫或高溫下易變質(zhì)的物品,但很費(fèi)時(shí)。③高壓蒸汽滅菌(熱壓滅菌法):超過一個(gè)大氣壓時(shí),水的沸點(diǎn)高于100℃,反之亦然。高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度,滅菌效果最好。它簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可靠、無毒,是最可靠、應(yīng)用最廣泛的滅菌法。此法適用于耐高溫和潮濕的物品。常用條件為:115.5℃
30min121.5℃
20min126.5℃
15min注意事項(xiàng):a.必須完全排出滅菌器內(nèi)的空氣。否則會(huì)影響滅菌器內(nèi)溫度達(dá)到規(guī)定的要求。b.注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內(nèi)溫度與被滅菌物品的溫度般是一致的,但在蒸汽輸入過快時(shí),后者可能低于前者,所以升溫時(shí)要有一定的預(yù)熱時(shí)間。另外,降溫過快易引起玻璃炸裂。因此,對(duì)于一種滅菌產(chǎn)品,應(yīng)制定固定的滅菌曲線(象凍干曲線樣)。c.定期檢查滅菌器內(nèi)溫度的準(zhǔn)確性。3、化學(xué)滅菌法
利用化學(xué)試劑形成的氣體來殺滅微生物的方法。常用的滅菌劑為環(huán)氧乙烷(又稱氧化乙烯)。4、濾過除菌法利用細(xì)菌不能通過致密具孔濾材的原理,除去對(duì)熱不穩(wěn)定的藥品溶液或液體物質(zhì)中的細(xì)菌的方法。過濾法般只能除菌,不能除去支原體和病毒。過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關(guān)。濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22pm。由于各廠家生產(chǎn)的相同規(guī)格的濾膜質(zhì)量并不一致,為了保證除菌效果,在使用前后應(yīng)檢查濾器的完好性(如壓力維持試驗(yàn)或起泡點(diǎn)試驗(yàn))。一個(gè)過濾器的使用時(shí)間應(yīng)根據(jù)品種驗(yàn)證后確定,一般不應(yīng)超過8小時(shí)。5、輻射滅菌法
輻射有兩種類型:一種是電磁波輻射,如紫外線、紅外線、微波;一種是電離輻射,如可引起被照射物電離的X射線、y射線。①紫外線:紫外光波長(zhǎng)在136~390nm之間,其中260nm左石能破壞核酸,殺菌作用最強(qiáng)。另外,空氣中的氧受紫外線照射后,可微量轉(zhuǎn)變?yōu)槌粞豕餐饸⒕饔?。紫外線消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時(shí)間、溫度和濕度等因素有關(guān)。我國(guó)規(guī)定紫外燈照射強(qiáng)度在距離1m處不低于70pW/cm2(以紫外線測(cè)強(qiáng)儀測(cè)定)在操作面上要求強(qiáng)度達(dá)40μW/cm2以上。一般每10m2裝30W燈管1支,工作前開30~60min。紫外燈的輸出功率隨使用時(shí)間增加而降低。國(guó)產(chǎn)紫外燈的平均壽命(點(diǎn)到70%額定功率的時(shí)間)一般為2000h,超過平均壽命時(shí),就達(dá)不到預(yù)期效果,必須更換。紫外線的穿透力很弱,不能穿透一般包裝材料,如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強(qiáng)烈吸收小于350nm的紫外線,石英玻璃能吸收小于200nm的紫外線。因此,它主要用于空氣和物體表面消毒,特制的紫外燈裝置也可用于水的消毒。②紅外線:通過加熱碳化硅板產(chǎn)生的輻射熱能,由空氣傳導(dǎo)加熱滅菌。如紅外線烤箱,溫度可達(dá)180℃左右。熱效應(yīng)特點(diǎn)是由表及里。③微波:微波滅菌主要是因其熱效應(yīng)。微波加熱升溫
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