《動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者技術(shù)規(guī)范》

ICS03.120.20

CCSA00

RB

中華人民共和國(guó)認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

RB/TXXXXX—XXXX

動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationforreferencematerialproducersofnucleicacidofanimal

quarantine

（征求意見(jiàn)稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布

XX/TXXXXX—XXXX

動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者的結(jié)構(gòu)要求，資源要求，技術(shù)和生產(chǎn)要求，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候

選物的要求，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、溯源性分析、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的文件和標(biāo)簽，

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與運(yùn)輸，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲(chǔ)存，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的管理等。

本文件適用于動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T15000.2標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第2部分：常用術(shù)語(yǔ)及定義

GB/T15000.3標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法

GB/T15000.4標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第4部分：證書(shū)、標(biāo)簽和附帶文件的內(nèi)容

GB/T15000.7標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第7部分：標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力的通用要求

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27420合格評(píng)定生物樣本測(cè)量不確定度評(píng)定與表示應(yīng)用指南

JJF1005標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通用術(shù)語(yǔ)和定義

JJF1265生物計(jì)量術(shù)語(yǔ)及定義

3術(shù)語(yǔ)和定義

GB/T15000.2，JJF1005，JJF1265界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)referencematerial；RM

標(biāo)準(zhǔn)樣品referencematerial；RM

具有一種或多種規(guī)定特性足夠均勻且穩(wěn)定的材料，已被確定其符合測(cè)量過(guò)程的預(yù)期用途。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.1]

3.2

有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)certifiedreferencematerial；CRM

有證標(biāo)準(zhǔn)樣品certifiedreferencematerial；CRM

4

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采用計(jì)量學(xué)上有效程序測(cè)定的一種或多種規(guī)定特性的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并附有證書(shū)提供規(guī)定特性值及其不

確定度和計(jì)量溯源性的陳述。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.2]

3.3

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物candidatereferencematerial

候選標(biāo)準(zhǔn)樣品candidatereferencematerial

擬作為標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)的材料。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.3]

3.4

最小樣本量minimumsamplesize

最小取樣量minimumsampleintake

標(biāo)準(zhǔn)樣品在測(cè)量過(guò)程中的用量下限，通常用質(zhì)量表示。該取樣量可確保標(biāo)準(zhǔn)樣品文件中所描述的值

或?qū)傩杂行А?/p>

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.8]

3.5

定值characterization

（標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值）標(biāo)準(zhǔn)樣品特性值或特性屬性的測(cè)定，是生產(chǎn)過(guò)程的一部分。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.10]

3.6

均勻性homogeneity

標(biāo)準(zhǔn)樣品中特定部分的某個(gè)規(guī)定特性值的一致性。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.12]

3.7

穩(wěn)定性stability

標(biāo)準(zhǔn)樣品在規(guī)定條件下貯存時(shí)的特性，其某個(gè)規(guī)定特性值在規(guī)定時(shí)間內(nèi)保持在規(guī)定限值范圍內(nèi)。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.15]

3.8

運(yùn)輸穩(wěn)定性transportationstability

標(biāo)準(zhǔn)樣品在運(yùn)輸條件下送達(dá)用戶時(shí)間內(nèi)特性的穩(wěn)定性。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.16]

3.9

長(zhǎng)期穩(wěn)定性long-termstability

5

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在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品特性的穩(wěn)定性。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.17]

3.10

有效期periodofvalidity

（標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期）標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者保證標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定的時(shí)間區(qū)間。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.1.19]

3.11

特性值propertyvalue

（標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值）表示標(biāo)準(zhǔn)樣品的物理、化學(xué)或生物所對(duì)應(yīng)特性量的值。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.2.1]

3.12

認(rèn)定值certifiedvalue

標(biāo)準(zhǔn)值certifiedvalue

賦予標(biāo)準(zhǔn)樣品特性的值，其具有不確定度和計(jì)量溯源性陳述，并在標(biāo)準(zhǔn)樣品證書(shū)中標(biāo)明。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.2.3]

3.13

計(jì)量溯源性metrologicaltraceability

通過(guò)具備證明文件的不間斷的校準(zhǔn)鏈，將測(cè)量結(jié)果與參照對(duì)象聯(lián)系起來(lái)的測(cè)量結(jié)果的特性，校準(zhǔn)鏈

中的每項(xiàng)校準(zhǔn)都會(huì)引入測(cè)量不確定度。

[來(lái)源：JJF1005-2016，4.9]

3.14

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)referencematerialcertificate

標(biāo)準(zhǔn)樣品證書(shū)referencematerialcertificate

包含使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本信息，確認(rèn)已采用必要的程序保證所述特性值有效性和計(jì)量溯源性的

文件。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.3.2]

3.15

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者referencematerialproducer；RMP

標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者referencematerialproducer；RMP

技術(shù)上有能力的機(jī)構(gòu)（組織或公司、公立或私營(yíng)），對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)的項(xiàng)目策劃和管理、特性值

及其不確定度的賦予和確定、特性值的批準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)樣品證書(shū)或其他文件發(fā)布負(fù)全部責(zé)任。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.3.5]

6

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3.16

生產(chǎn)production

（標(biāo)準(zhǔn)樣品的生產(chǎn)）為發(fā)布和維護(hù)（有證或非有證）標(biāo)準(zhǔn)樣品開(kāi)展的所有必要活動(dòng)和任務(wù)。

[來(lái)源：GB/T15000.2-2019，2.3.7]

3.17

質(zhì)粒plasmid

細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子,能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外,并傳遞到子代,一般

不整合到宿主染色體上。

[來(lái)源：JJF1265-2010，4.28]

3.18

脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid（DNA）

一類帶有遺傳信息的生物大分子。有四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺苷dAMP、脫氧單磷酸鳥(niǎo)

嘌呤dGMP、脫氧單磷酸胞嘧啶dCMP和脫氧單磷酸胸腺嘧啶dTMP)通過(guò)3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成。它

們的組成和排列不同,顯示出不同的生物功能,如編碼功能、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控功能等。排列的變異可能

產(chǎn)生一系列疾病。

[來(lái)源：JJF1265-2010，4.30]

3.19

核糖核酸ribonucleicacid（RNA）

核酸的一類。由核苷酸通過(guò)3′,5′-磷酸二酯鍵連接而成的多聚體。不同種類的RNA鏈長(zhǎng)不同,行使

各式各樣的生物功能,如參加與蛋白質(zhì)生物合成的RNA有信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA和核糖體RNA;與轉(zhuǎn)錄后加工

有關(guān)的RNA有核小RNA、核仁小RNA;與生物調(diào)控有關(guān)的RNA有微RNA、干擾小RNA等。

[來(lái)源：JJF1265-2010，4.32]

3.20

核酸nucleicacid

由核苷酸或脫氧核苷酸通過(guò)3，，5，-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。具有非常重要的生物

功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。包括核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）兩類。

[來(lái)源：JJF1265-2010，4.42]

3.21

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction（PCR）

聚合酶鏈反應(yīng)是一種對(duì)特定DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法,由變性—退火—延伸三個(gè)基本反

應(yīng)步驟構(gòu)成。

[來(lái)源：JJF1265-2010，5.15]

4結(jié)構(gòu)要求

7

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4.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)符合GB/T15000.7規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者能力的通用要求，應(yīng)具有明確的法律

地位，建立完備的質(zhì)量管理體系。

4.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)具備GB/T15000.7要求的生產(chǎn)者能力，具備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)所必需的工作場(chǎng)所、

儀器設(shè)備、專業(yè)人員及管理等條件。

4.3從事動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)的場(chǎng)所，應(yīng)符合GB19489的規(guī)定，應(yīng)依據(jù)病原微生物的危害級(jí)別

進(jìn)行安全控制，防止病原微生物擴(kuò)散，避免在樣品制備過(guò)程中對(duì)環(huán)境造成影響。

5資源要求

5.1人員

5.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)制定保密信息管理政策和程序，并確保所有涉及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)的人員遵守該

程序。

5.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)制定人員教育、培訓(xùn)、監(jiān)督、授權(quán)的政策和程序，并按照程序的規(guī)定對(duì)人員

進(jìn)行管理。

5.1.3動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保所有依據(jù)管理體系要求從事標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)的人員（包括技

術(shù)管理人員）的能力，且滿足以下條件：

a）應(yīng)具有病原分子生物學(xué)相關(guān)專業(yè)的教育經(jīng)歷；

b）應(yīng)熟知生物安全操作知識(shí)和消毒要求，并具備實(shí)際操作技能；

c）有顏色視覺(jué)障礙的人員不能操作涉及到辨色的實(shí)驗(yàn)。

5.1.4人員培訓(xùn)和持續(xù)教育計(jì)劃應(yīng)包括動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、貯存、運(yùn)輸、生物安全防護(hù)、

統(tǒng)計(jì)分析等內(nèi)容。

5.2設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品的采購(gòu)

5.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)制定對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量有影響的設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品進(jìn)行選擇的政策和程序。

應(yīng)根據(jù)程序的規(guī)定，選擇保證其生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量的設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品。

5.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)保存其設(shè)備、服務(wù)和供應(yīng)品的購(gòu)買(mǎi)記錄，包括所選用標(biāo)準(zhǔn)、驗(yàn)收確認(rèn)書(shū)和所

有調(diào)試數(shù)據(jù)的記錄。

5.2.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保設(shè)備和耗材在經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)、校準(zhǔn)或質(zhì)量驗(yàn)證符合標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)的規(guī)格或要

求之后方可使用。

5.2.4動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保每一區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，并貼有明確的標(biāo)識(shí)，以避

免設(shè)備物品從其各自的區(qū)域內(nèi)移出，造成不同的工作區(qū)域間的交叉污染。

5.2.5適用時(shí)，設(shè)備和供應(yīng)品要定期進(jìn)行期間核查以保證其性能持續(xù)符合要求。

5.2.6動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)有專用的低溫儲(chǔ)存設(shè)備，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)材料不應(yīng)與其他檢測(cè)或

科研材料混放。

5.3設(shè)施和環(huán)境條件

5.3.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保所有場(chǎng)所和設(shè)施的能源、照明、濕度、溫度、壓力和通風(fēng)設(shè)備應(yīng)有利于

材料處置、存儲(chǔ)、制備、包裝等。并應(yīng)防止不相容的活動(dòng)、振動(dòng)、氣溶膠、粉塵、微生物污染、磁場(chǎng)、

光和電磁場(chǎng)和/或電離輻射等其他環(huán)境因素的影響。

5.3.2動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)有相應(yīng)級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)按照GB19489的規(guī)定使用與

生物安全等級(jí)相對(duì)應(yīng)的生物危害標(biāo)識(shí)。

8

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5.3.3動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)有分隔開(kāi)的試劑配制與貯存區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸

擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，無(wú)菌區(qū)域和污染區(qū)域應(yīng)張貼明顯標(biāo)識(shí)。應(yīng)對(duì)進(jìn)入和使用工作區(qū)域的人員進(jìn)行

嚴(yán)格控制。不同的工作區(qū)域應(yīng)使用有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，人員離開(kāi)工作區(qū)時(shí)不得將各區(qū)特定的工作

服帶出。

6技術(shù)和生產(chǎn)要求

6.1生產(chǎn)策劃

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者在進(jìn)行生產(chǎn)策劃時(shí)應(yīng)考慮材料的選擇；材料的加工；測(cè)量程序的選擇及確認(rèn)；測(cè)量

設(shè)備的驗(yàn)證和校準(zhǔn)；均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)方法選擇和經(jīng)過(guò)的接受準(zhǔn)則；定值方式的設(shè)計(jì)；特性值的賦予；

不確定度的建立及評(píng)估；計(jì)量溯源性的建立；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)文件的發(fā)布；貯存設(shè)施和條件；標(biāo)簽、包裝和運(yùn)

輸方案設(shè)計(jì)；生產(chǎn)后的穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)等。

6.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的選擇

6.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的數(shù)量、純度及特性值應(yīng)滿足預(yù)期用途。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物應(yīng)具有足夠的用量，

以滿足批量生產(chǎn)的需求。其純度應(yīng)滿足均勻性和穩(wěn)定性的要求。其特性值應(yīng)穩(wěn)定且在可測(cè)量范圍內(nèi)，并

應(yīng)經(jīng)過(guò)適合性測(cè)試，如代表性、檢測(cè)靈敏度、特異性等。

6.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物應(yīng)由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)機(jī)構(gòu)提供或從權(quán)威實(shí)驗(yàn)室獲得，并具有穩(wěn)定的獲得途徑。標(biāo)

準(zhǔn)物質(zhì)候選物應(yīng)具有可追溯的、詳實(shí)的來(lái)源信息記錄。應(yīng)選用有效的方法驗(yàn)證其真實(shí)性，必要時(shí)可由多

家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行聯(lián)合驗(yàn)證。通過(guò)擴(kuò)繁或繼代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，應(yīng)重新驗(yàn)證其目標(biāo)特性值。

6.2.3動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)按照GB19489的規(guī)定，根據(jù)動(dòng)物檢疫病原傳播擴(kuò)散的不同特點(diǎn)，對(duì)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行安全控制。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)應(yīng)根據(jù)病原類型在相應(yīng)生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)

行，防止病原擴(kuò)散傳播，避免對(duì)操作人員和環(huán)境造成影響。

6.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

6.3.1動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照制備工藝流程和產(chǎn)物不同，可分為病原體滅活標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、病原體DNA

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、病原體質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、病原體體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、假病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等，具體制

備工藝流程見(jiàn)附錄A。

6.3.2應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的預(yù)期用途和病原微生物的特性，選擇合理的原材料、制備方法和工藝流程。

6.3.3對(duì)目標(biāo)特性值不易均勻的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，在制備過(guò)程中應(yīng)采取必要的均勻措施。

6.3.4對(duì)目標(biāo)特性值存在不穩(wěn)定因素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，在制備過(guò)程中應(yīng)采取必要的穩(wěn)定性措施。

6.3.5生產(chǎn)和存儲(chǔ)動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的器具應(yīng)確保不存在影響特性值的因子，如吸附性、滲透性、

水溶性等。

6.3.6動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分裝，應(yīng)在特定條件下進(jìn)行，避免生物、化學(xué)和物理方面的污染，同

一批次所有分裝單元應(yīng)在同一時(shí)間完成。

6.4溯源性分析

6.4.1核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值是序列，測(cè)定方法為序列測(cè)定，溯源標(biāo)準(zhǔn)為參考序列，證據(jù)文件為

GenBank標(biāo)準(zhǔn)序列，序列測(cè)定結(jié)果文件等。

6.4.2選取的病原體應(yīng)溯源至具有代表性的參考菌、毒株。

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6.4.3核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)后，電泳條帶明亮清晰、條帶單一無(wú)雜帶、片段長(zhǎng)度與

預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)過(guò)至少3家機(jī)構(gòu)測(cè)序及BLAST分析，同源性應(yīng)達(dá)到特定病原的要求。

6.5均勻性檢驗(yàn)

6.5.1基本要求

6.5.1.1凡成批制備并分裝成最小包裝單元的動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，都應(yīng)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。均勻性

檢驗(yàn)應(yīng)采用相應(yīng)病原的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的核酸檢測(cè)方法進(jìn)行，通常采用PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR或

數(shù)字PCR等方法。

6.5.1.2所有樣品應(yīng)以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下進(jìn)行測(cè)試，即在同一實(shí)驗(yàn)室中由相同的人員使用相同

的測(cè)試方法和儀器在較短時(shí)間內(nèi)測(cè)試。

6.5.1.3定性（不具備數(shù)值）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性通過(guò)特異性條帶大小以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距

進(jìn)行判定。

6.5.1.4定量（具備數(shù)值）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)判定均勻性檢驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可按

照GB/T15000.3的規(guī)定選擇。

6.5.2取樣方式、取樣數(shù)目和最小取樣量

6.5.2.1按照GB/T15000.3的規(guī)定從分裝成最小包裝單元的樣品中抽樣。取樣應(yīng)考慮引起特性值的差

異原因，從特性值可能出現(xiàn)差異的部位抽取，抽取的單元分布應(yīng)有足夠的代表性。當(dāng)引起特性值的差異

原因未知或認(rèn)為不存在差異時(shí)，可先將樣品順序編碼，采用隨機(jī)數(shù)表決定抽取樣品的號(hào)碼。

6.5.2.2當(dāng)總體單元數(shù)少于等于200時(shí)，抽取單元數(shù)不少于11個(gè)；當(dāng)總體單元數(shù)多于200但少于等于

500時(shí)，抽取單元數(shù)不少于15個(gè)；當(dāng)總體單元數(shù)大于500但少于等于1000時(shí)，抽取單元數(shù)不少于25

個(gè)；當(dāng)總體單元數(shù)大于1000時(shí)，抽取單元數(shù)不少于30個(gè)。對(duì)于均勻性好的樣品，當(dāng)總體單元數(shù)少于等

于500時(shí)，抽取單元數(shù)不少于10個(gè)；當(dāng)總體單元數(shù)大于500時(shí)，抽取單元數(shù)不少于15個(gè)。

6.5.2.3最小取樣量多少是由用來(lái)檢驗(yàn)均勻性所采用的方法決定的，一旦最小取樣量確定，該標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)定值和使用時(shí)都應(yīng)保證用量不少于該最小取樣量。

6.5.3結(jié)果判定

6.5.3.1定性（不具備數(shù)值）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以擴(kuò)增的特異性條帶大小的一致性，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截

距的一致性進(jìn)行判定。

——若擴(kuò)增的特異性條帶大小一致且標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距一致，則樣品均勻；

——若擴(kuò)增的特異性條帶大小、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距任何一項(xiàng)不一致，則樣品不均勻。

6.5.3.2定量（具備數(shù)值）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用適用的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析，得到統(tǒng)計(jì)值并與統(tǒng)計(jì)值分布表上

的臨界值進(jìn)行比較。

——若統(tǒng)計(jì)值小于臨界值，表示無(wú)顯著性差異，則樣品均勻；

——若統(tǒng)計(jì)值大于臨界值，表示有顯著性差異，則樣品不均勻。

6.6穩(wěn)定性檢驗(yàn)

6.6.1基本要求

6.6.1.1動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在規(guī)定的保存或使用條件下，應(yīng)定期進(jìn)行特性值的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。穩(wěn)定

性檢驗(yàn)應(yīng)在均勻性檢驗(yàn)證明樣品均勻性后進(jìn)行。穩(wěn)定性檢驗(yàn)所用人員、儀器、測(cè)試方法和實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)與

均勻性檢驗(yàn)相同。

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6.6.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有效期應(yīng)不少于1年。保存期間需要對(duì)動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性條件進(jìn)行連

續(xù)監(jiān)測(cè)。在預(yù)期有效期間應(yīng)有多個(gè)時(shí)間間隔的穩(wěn)定性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)記錄穩(wěn)定性檢驗(yàn)期間的環(huán)境條件。

6.6.2溫度和時(shí)間間隔

6.6.2.1運(yùn)輸穩(wěn)定性測(cè)定溫度為4℃、25℃，測(cè)定時(shí)間點(diǎn)為0周、1周、2周、4周等。

6.6.2.2長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)定溫度為-20℃和-80℃，測(cè)定時(shí)間點(diǎn)為0月、1月、2月、3月、6月、9月、

12月、18月、24月等。

6.6.3樣品的抽取

穩(wěn)定性檢驗(yàn)所用樣品應(yīng)從最小包裝單元的樣品中隨機(jī)抽取。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有多個(gè)待定特性值時(shí)，應(yīng)選

擇那些易變的和有代表性的特性值進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

6.6.4結(jié)果評(píng)價(jià)

分裝成最小包裝后的樣品按時(shí)間順序進(jìn)行測(cè)量，可依據(jù)GB/T15000.3的規(guī)定選擇適用的統(tǒng)計(jì)方法

進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)。如測(cè)量結(jié)果在隨機(jī)不確定度范圍內(nèi)波動(dòng)，則該特性值在試驗(yàn)的時(shí)間間隔內(nèi)是

穩(wěn)定的。

6.7定值

6.7.1基本要求

6.7.1.1經(jīng)過(guò)均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)合格并具有一定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方可進(jìn)行定值。

6.7.1.2動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)采用多個(gè)機(jī)構(gòu)合作定值的方式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行確定。參與

合作定值的機(jī)構(gòu)應(yīng)具有技術(shù)權(quán)威性，并具有必備的環(huán)境和設(shè)施條件及所需的技術(shù)能力和經(jīng)驗(yàn)。定值過(guò)程

所用量具和儀器，應(yīng)在檢定/校準(zhǔn)合格的有效期內(nèi)。

6.7.2定值方法

6.7.2.1可采用一種或多種準(zhǔn)確可靠的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)采用同一種定值測(cè)量方

法時(shí)，獨(dú)立定值實(shí)驗(yàn)室數(shù)一般不少于8個(gè)；當(dāng)采用多種定值測(cè)量方法時(shí)，獨(dú)立定值實(shí)驗(yàn)室數(shù)一般不少于

6個(gè)。

6.7.2.2定性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值為特定核酸序列。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)后，電泳條帶

明亮清晰、條帶單一無(wú)雜帶、片段長(zhǎng)度與預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)過(guò)至少3家機(jī)構(gòu)測(cè)序及BLAST分析，

同源性應(yīng)達(dá)到特定病原的要求。參與合作定值的所有結(jié)果應(yīng)保持定性水平上的一致。

6.7.2.3定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值為特定核酸含量。不同機(jī)構(gòu)的合作定值結(jié)果應(yīng)選取適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)

行檢驗(yàn)?？蛇M(jìn)行格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)法或夏皮羅-威爾克（Shapiro-Wilk）檢驗(yàn)法等進(jìn)行正態(tài)分布

檢驗(yàn)，在從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的情況下，再將每個(gè)機(jī)構(gòu)的測(cè)定數(shù)值的平均值視為單次測(cè)量值，構(gòu)

成一組新的測(cè)量數(shù)據(jù)，進(jìn)行格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，剔除離群值后將該組數(shù)據(jù)的平均值作為認(rèn)

定值。對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中間值定值。

6.8總不確定度的評(píng)估

6.8.1總不確定度的評(píng)定方法應(yīng)按照GB/T27420中的有關(guān)技術(shù)及文書(shū)要求進(jìn)行。

6.8.2認(rèn)定值的總不確定量來(lái)源包括通過(guò)測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置性水平按統(tǒng)計(jì)

方法計(jì)算得出；通過(guò)對(duì)測(cè)量影響參數(shù)和影響函數(shù)的分析、估計(jì)得出；樣品不均勻和樣品在有效期內(nèi)的變

動(dòng)性所引起的不確定度等。

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7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的文件和標(biāo)簽

7.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)布提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)，并為其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)布提供產(chǎn)品說(shuō)明

書(shū)。

7.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)應(yīng)至少包括文件標(biāo)題；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的唯一性標(biāo)識(shí)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的名稱；標(biāo)

準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者的名稱和聯(lián)系信息；預(yù)期用途；最小取樣量；有效期；儲(chǔ)存信息；充分確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)完整

性的處置與使用說(shuō)明。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)還應(yīng)包括有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一般描述；特性值和相關(guān)不確定度；由程

序定義的被測(cè)量的測(cè)量程序；標(biāo)準(zhǔn)值的計(jì)量溯源性；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者批準(zhǔn)人的姓名和職務(wù)。

7.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)簽應(yīng)牢固地粘貼在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獨(dú)立包裝單元的產(chǎn)品容器上，并應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期內(nèi)，

在規(guī)定的儲(chǔ)存和處置條件下保持清晰和完整。標(biāo)簽應(yīng)標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、生產(chǎn)者、批次及其他必要的信息，

使得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠被唯一識(shí)別和引用。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包裝單元的實(shí)際尺寸限制了標(biāo)簽上的信息量時(shí)，這些

信息應(yīng)包含在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)文件中，包裝單元上應(yīng)給出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的唯一標(biāo)識(shí)符。

8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與運(yùn)輸

8.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝應(yīng)具有良好的密封性。根據(jù)動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不同病原特性選擇合適的包

裝容器，例如，可采用避光、抽真空、防潮或惰性氣體包裝，以確保包裝不對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值產(chǎn)生不

良影響。

8.2動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)保證低溫運(yùn)輸，同時(shí)對(duì)于玻璃容器應(yīng)有能夠提供緩沖的外包裝，并寫(xiě)有

“易碎品”字樣。

9標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的儲(chǔ)存

9.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有專門(mén)的儲(chǔ)存場(chǎng)所或冰箱，并與化學(xué)試劑和其他用途材料隔離。

9.2密封后的動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)置于-20℃或-80℃儲(chǔ)存，儲(chǔ)存條件應(yīng)與穩(wěn)定性檢驗(yàn)條件一致。

9.3應(yīng)對(duì)儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控（如溫濕度），保證儲(chǔ)存環(huán)境條件的符合性及持續(xù)性。

10標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的管理

10.1動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備完成后應(yīng)對(duì)其實(shí)施合理有效地管理。

10.2應(yīng)對(duì)在儲(chǔ)存期內(nèi)的動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢查，應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在整個(gè)儲(chǔ)存期間的狀況進(jìn)行定

期評(píng)估。當(dāng)發(fā)生動(dòng)物檢疫核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過(guò)期、變質(zhì)、包裝破裂、標(biāo)簽破損等情況時(shí)，應(yīng)及時(shí)將其從存放

處撤除，并用合適的方式處理，以免誤用。

10.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外部評(píng)價(jià)程序，以確保所生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量。評(píng)價(jià)至少包括證

書(shū)規(guī)范評(píng)價(jià)和其特性值評(píng)價(jià)。證書(shū)規(guī)范性評(píng)價(jià)應(yīng)按照GB/T15000.4、GB/T15000.7和我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管

理辦法進(jìn)行。特性值的評(píng)價(jià)應(yīng)包括測(cè)量值、穩(wěn)定性及均勻性。以上評(píng)價(jià)獨(dú)立測(cè)量數(shù)目應(yīng)不少于6個(gè)。

12

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附錄A

（資料性）

A.1病原體滅活標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

A.1.1工藝流程（見(jiàn)圖A.1）

圖A.1病原體滅活標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖

A.1.2病原體的選擇、鑒定和增殖

根據(jù)本文件6.2條所規(guī)定的原則選取病原體，采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)、生化鑒定和特

異性基因片段的PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果符合預(yù)期的病原體使用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行增殖。

A.1.3樣品的制備及滅活

選取適當(dāng)?shù)慕臃N比例，將病原體接種到培養(yǎng)基（細(xì)菌）或細(xì)胞培養(yǎng)液（病毒）中，在標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定

的條件下培養(yǎng)并收集純化增值后的病原體。根據(jù)病原體特性選取適宜的物理或化學(xué)方法進(jìn)行滅活，滅活

后離心取上清，并采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)滅活效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

A.1.4初步定值、分裝和保存

提取滅活病原體DNA或RNA，并使用已知拷貝數(shù)的外標(biāo)品，通過(guò)實(shí)時(shí)定量外標(biāo)法經(jīng)線性回歸分析，獲

得滅活病原體DNA或RNA的拷貝數(shù)。根據(jù)定值結(jié)果，用核酸保存液將滅活病原體離心取上清的產(chǎn)物稀釋至

8

10Copies/μL，充分混勻后分裝入凍存管中，加貼唯一性標(biāo)識(shí)后，置-80℃保存。

A.2病原體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

A.2.1工藝流程（見(jiàn)圖A.2）

13

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圖A.2病原體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖

A.2.2病原體的選擇、鑒定和增殖

同A.1.2。

A.2.3病原體DNA的提取和純化

病原體DNA選用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，DNA提取物溶解在pH8.0的TE緩沖液中，并在-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｓ?/p>

于制備病原體DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DNA相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)盡可能大，因此核酸提取過(guò)程中操作盡可能溫和，提取

過(guò)程盡量在低溫下進(jìn)行。另外，制備的病原體DNA必須是高純度的，沒(méi)有蛋白質(zhì)和RNA污染，各種離子濃

度也應(yīng)符合要求，提取過(guò)程中使用的玻璃器皿、試劑、離心管等一次性用品都應(yīng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌消毒。

A.2.4核酸純度的檢測(cè)

采用分光光度計(jì)法測(cè)試DNA在260nm和280nm下的吸光度，以O(shè)D260/OD280的比值來(lái)判斷提取的DNA純

度。如果OD260/OD280在1.7～2.0之間，表明所提取的DNA較純；當(dāng)OD260/OD280<1.7時(shí)，說(shuō)明所提取的DNA有

蛋白質(zhì)污染；OD260/OD280>2.0時(shí)，說(shuō)明提取的DNA有RNA污染。在提取的DNA不純時(shí)，應(yīng)重新提取。

A.2.5初步定值、分裝和保存

使用已知拷貝數(shù)的外標(biāo)品，通過(guò)實(shí)時(shí)定量外標(biāo)法經(jīng)線性回歸分析，獲得滅活病原體DNA的拷貝數(shù)。

8

根據(jù)定值結(jié)果，用核酸保存液將滅活病原體離心取上清的產(chǎn)物稀釋至10Copies/μL，充分混勻后分裝入

凍存管中，加貼唯一性標(biāo)識(shí)后，置-80℃保存。

A.3病原體質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

A.3.1工藝流程（見(jiàn)圖A.3）

14

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圖A.3病原體質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖

A.3.2病原體的選擇、鑒定和增殖

同A.1.2。

A.3.3質(zhì)粒的構(gòu)建

將病原體滅活后，進(jìn)行基因擴(kuò)增。應(yīng)選擇具有檢測(cè)或分型意義的基因片段，選擇的基因片段應(yīng)足夠

長(zhǎng)，應(yīng)涵蓋一般檢測(cè)方法和試劑的檢測(cè)范圍。獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后連接到載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸

桿菌感受態(tài)細(xì)胞。PCR驗(yàn)證挑選陽(yáng)性克隆，對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，確保序列無(wú)突變，與已知序列完

全一致。

A.3.4質(zhì)粒DNA純度檢測(cè)及初步定值

將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌落大量培養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)方法提取質(zhì)粒DNA，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)試DNA

在260nm和280nm下的吸光度，以O(shè)D260/OD280的比值來(lái)判斷提取的質(zhì)粒DNA純度。如果OD260/OD280在1.8～2.0

之間，表明所提取的DNA較純；當(dāng)OD260/OD280<1.8時(shí)，說(shuō)明所提取的DNA有蛋白質(zhì)污染；OD260/OD280>2.0時(shí)，

說(shuō)明提取的DNA有RNA污染。若提取的DNA不純，應(yīng)重新提取。

質(zhì)粒DNA濃度按照公式（A.1）計(jì)算，并根據(jù)質(zhì)粒DNA分子量，按照公式（A.2）換算為Copies/μL。

DNA濃度（μg/mL）=OD260nm×50μg/mL×稀釋倍數(shù)（A.1）

-114

DNA濃度（Copies/μL）=OD260nm×50×M.W.×6.02×10×稀釋倍數(shù)（A.2）

A.3.5稀釋、分裝和保存

8

根據(jù)初步定值結(jié)果，用核酸保存液將制備好的質(zhì)粒DNA稀釋至10Copies/μL，充分混勻后分裝入凍存

管中，加貼唯一性標(biāo)識(shí)后，置-80℃保存。

15

XX/TXXXXX—XXXX

A.4病原體體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

A.4.1工藝流程（見(jiàn)圖A.4）

圖A.4病原體RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備工藝流程圖

A.4.2病原體的選擇、鑒定和增殖

同A.1.2。

A.4.3質(zhì)粒的構(gòu)建

同A.3.3。

A.4.4病原體RNA的體外轉(zhuǎn)錄

將純化后的質(zhì)粒用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行酶切。T7（或SP6）啟動(dòng)子與插入片段以及插入片段中

間不應(yīng)有此限制性內(nèi)切酶作用的酶切位點(diǎn)，而且酶切后的末端不形成5’懸掛。獲得的線性化片段進(jìn)行體

外轉(zhuǎn)錄，對(duì)獲得的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化。使用脫氧核糖核酸酶DNase除去其中的DNA模板，使用TRIZOL

再次抽提RNA，即得到體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA母液。

A.4.5體外轉(zhuǎn)錄RNA純度檢測(cè)及初步定值

采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)試RNA在260nm和280nm下的吸光度，以O(shè)D260/OD280的比值來(lái)判斷體外轉(zhuǎn)錄

RNA純度。要求OD260/OD280在1.9～2.1之間。RNA濃度按照公式（A.3）計(jì)算，并根據(jù)RNA分子量，按照

公式（A.4）換算為Copies/μL。

RNA濃度（μg/mL）=OD260nm×40μg/mL×稀釋倍數(shù)（A.3）

RNA濃度（Copies/μL）=OD260nm×40×M.W.-1×6.02×1014×稀釋倍數(shù)（A.4）