食品分析第十一章-蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

第十一章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定1、蛋白質(zhì)的測(cè)定原理、測(cè)定方法、注意事項(xiàng)。2、氨基酸的測(cè)定原理、測(cè)定方法、注意事項(xiàng)。1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)和測(cè)定意義；2、凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法摘要；3、熟悉凱氏定氮儀的工作原理和使用方法。2.重點(diǎn)1、凱氏定氮法中蛋白質(zhì)原理和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。3.難點(diǎn)3.1.基本知識(shí)點(diǎn)食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定學(xué)習(xí)目標(biāo)§1概述一、蛋白質(zhì)概況蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S元素組成。有些還含有微量的P、Cu、Fe、I等。含氮是蛋白質(zhì)的主要標(biāo)志。在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測(cè)）。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%~13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。二.測(cè)定意義1.蛋白質(zhì)是組成人體的重要成分之一，人體的一切細(xì)胞都由蛋白質(zhì)組成。

2.蛋白質(zhì)維持體內(nèi)酸堿平衡。

3.蛋白質(zhì)是食品的重要組織部分之一，也是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

4.蛋白質(zhì)是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量高低的指標(biāo)，還關(guān)系到人體健康。

三、蛋白質(zhì)測(cè)定方法一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量；一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。具體測(cè)定方法：凱氏定氮法——最常用的，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法國(guó)外：紅外分析儀氨基酸的測(cè)定方法：酸堿滴定法——測(cè)定氨基酸總量。色譜技術(shù)——各種氨基酸的分離與定量。有多種氨基酸分析儀?！?蛋白質(zhì)的定性測(cè)定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并顯色。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（二）脂蛋白的顯色§3蛋白質(zhì)的定量測(cè)定

一般說來，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。一、凱氏定氮法新鮮食品中的含氮物質(zhì)大都以蛋白質(zhì)為主體，所以檢驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)時(shí)，往往只限于測(cè)定總氮量，然后乘以換算系數(shù)，即可得到蛋白質(zhì)含量。由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。一些蛋白質(zhì)的含氮量

一般為15%~17.6%，有的上下浮動(dòng)

可以測(cè)出總氮N

=N×6.25=蛋白質(zhì)含量

一般蛋白質(zhì)含氮量是16%，即1gN約等于6.25g蛋白質(zhì)（一）常量凱氏定氮法1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量。（1）樣品消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后炭化為碳、氫、氮；濃硫酸具有氧化性，將碳變?yōu)槎趸迹蛩釀t被還原成二氧化硫；2H2SO4+C2SO2+2H2O+CO2為縮短消化時(shí)間常加入以下試劑：硫酸鉀

作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，加速氧化，促進(jìn)有機(jī)物分解；純硫酸沸點(diǎn)340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。

硫酸鉀不宜用太多，否則溫度太高，生成的硫酸銨容易分解。硫酸銅

作為催化劑同時(shí)作為消化終點(diǎn)指示劑。也可加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。氧化劑

如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。消化（2）蒸餾消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3+Na2SO4+H2O以硫酸銅作為指示劑，判斷終點(diǎn)；當(dāng)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)楹谏趸~時(shí)，說明蒸餾完全。蒸餾

（3）吸收與滴定加熱蒸餾放出的氨，用硼酸溶液吸收，吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅-溴甲基酚綠混合指示劑或用亞甲基蘭-甲基紅）。2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7(NH4)2B4O7+5H2O+2HCL2NH4CL+4H3BO3

混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈紅色。

結(jié)果計(jì)算式中：X—試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100g或g/100mL；V1—試樣消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2—試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；M—N的摩爾質(zhì)量，14.01g/mol；m—樣品的質(zhì)量或體積，g；F—氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；玉米、高粱為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為5.30。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。2.適用范圍

此法用于各類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。3.說明①所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。②消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持緩和沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。③消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。④樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。⑤當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。⑥若取樣量較大，如干試樣超過5g可按每克試樣5m1的比例增加硫酸用量。⑦—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的樣品．如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。⑧蒸餾裝置不能漏氣。⑨蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。

⑩蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。⑾混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈紅色。（二）微量凱氏定氮法1.原理同凱氏定氮法。2.樣品消化同凱氏定氮法。3.試劑濃度及用量與常量法不同如：加入硼酸量有50ml10ml

滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L10-210-24.說明蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足，防止發(fā)生倒吸。蒸汽發(fā)生器中的水裝至2/3容積，且要保持酸性，防止水中氨被蒸出。（三）自動(dòng)凱氏定氮法特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。凱氏定氮儀

二、雙縮脲法1.原理

脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150~160℃時(shí)，兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子生成雙縮脲。NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3

雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—

與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測(cè)其吸光度，確定含量；該配合物的最大吸收波長(zhǎng)為560nm。2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍

本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。三．紫外吸收法1.原理蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)殘基在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)一定波長(zhǎng)的光有吸收作用。在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系。│R（—NH—CH—CO）2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。四、福林-酚比色法原理：

蛋白質(zhì)與福林-酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機(jī)理主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)由于蛋白質(zhì)中存在酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑顯色。顏色深淺與蛋白質(zhì)含量呈正比。

福林酚法靈敏度高，實(shí)測(cè)下限較雙縮脲法約小2個(gè)數(shù)量級(jí)。五、考馬斯亮藍(lán)染料比色法原理：考馬斯亮藍(lán)G250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在620nm處有最大吸收，可定量測(cè)定蛋白質(zhì)。此法簡(jiǎn)單快速，不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響，靈敏度和福林-酚相似。六、染料結(jié)合法原理：在特定條件下，蛋白質(zhì)可與某些染料定量結(jié)合而生成沉淀，用分光光度計(jì)測(cè)定沉淀反應(yīng)完成后剩余的染料量，可計(jì)算出反應(yīng)消耗的染料量，從而計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量。適用范圍：適用牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力飲料、脫脂乳粉等食品。§4氨基酸的定量測(cè)定一．氨基酸的一般定量測(cè)定（一）甲醛滴定法原理：氨基酸本身有堿性—NH2—

基，又有酸性—COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，甲醛與—NH2—

結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定—COOH基。特點(diǎn)：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測(cè)定）

樣液中有其他的酸性物質(zhì)使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確；3．雙指示劑：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性紅50%乙醇溶液，④0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4．操作：同時(shí)取兩份樣：①+中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質(zhì)。②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。二者之差可計(jì)算氨基酸含量

（二）電位滴定法

原理：根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成原電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的PH值判定滴定終點(diǎn)。

（三）茚三酮的比色法

原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測(cè)定。

最大吸收波長(zhǎng)為570nm?！?氨基酸的分離與測(cè)定

一．薄層色譜法（薄層層析法（TLC法）近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。（一）原理：

取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等