DB51T 2458-2018 大鯢蛙病毒病診斷技術(shù)規(guī)程

12018-04-18發(fā)布2018-05-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I II 1 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 1 26臨床檢查 2 2 29病毒鑒定 3 4附錄A(規(guī)范性附錄)試劑配方 5附錄B(資料性附錄)大鯢蛙病毒MCP基因參考序列(531bp) 6Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)定進(jìn)行編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)中附錄A為規(guī)范性附錄、附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：耿毅、劉丹、余澤輝、陳德芳、黃小麗、歐陽(yáng)萍、鄧夢(mèng)玲。1大鯢蛙病毒病診斷技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大鯢蛙病毒病診斷的術(shù)語(yǔ)與定義、試劑和材料、臨床檢查、實(shí)驗(yàn)室樣品采集、病毒分離、病毒鑒定和綜合判定等技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大鯢蛙病毒病的診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于文件的應(yīng)用時(shí)必不可少的。凡是注日期的應(yīng)用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法SC/T7014水生動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于此文件。大鯢蛙病毒病指由大鯢蛙病毒(Chinesegiantsalamanderranavirus,CGSRV)感染引起的大鯢發(fā)病或死亡的一種病毒性疾病。細(xì)胞病變效應(yīng)。EPCEpitheliomapapulosumcyprini鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞。主要外膜蛋白基因。4試劑和材料2用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。4.2試劑與培養(yǎng)基按GB/T4789.28與SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(EPC)、小牛血清(FBS)、M199營(yíng)養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、Mix-reactionbuffer、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物與核酸提取試劑盒等選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑，上述未提及的見(jiàn)附錄A。MCP基因序列PCR擴(kuò)增引物：P1-F:5'-GACTTGGCCACTTAGA-3’,P1-R:5'-GTCTCTGGAGAAGAGAA-3’。-20℃保存。5設(shè)備和器械主要設(shè)備與器械如下：解剖盤(pán)、剪刀、鑷子和手術(shù)刀、組織勻漿器、電子天平、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、普通冰箱、超低溫冰箱、一次性濾器(0.22μm)、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、微量移液器、PCR擴(kuò)增儀、水平電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)與CO?培養(yǎng)箱等。6臨床檢查6.1臨床癥狀病鯢食欲減退，攝食減少，甚至停止攝食，部分病鯢出現(xiàn)嘔吐，偶爾嘔吐物混有血液；體表粘液分泌增多，活動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，常靜臥池底。6.2外部檢查病鯢全身性腫脹、出血，尤其頭部與四肢明顯，體表皮膚與肌肉潰爛，形成潰瘍，嚴(yán)重時(shí)腫脹的四肢潰爛。6.3剖檢口腔黏膜偶見(jiàn)出血與潰瘍；腹腔常見(jiàn)淡黃色澄清或含血液體；肝腫大，淤血、出血，呈花斑狀；脾腫大，嚴(yán)重瘀血呈紫黑色或散在灰白色壞死灶；腎腫大，斑點(diǎn)狀出血；肺囊充血、出血；胃腸道呈出血性一卡他性炎。7實(shí)驗(yàn)室樣品采集樣品采集按SC/T7103與GB/T18088執(zhí)行。體長(zhǎng)≤5cm的大鯢苗取整條，體長(zhǎng)5-10cm的大鯢苗取內(nèi)臟(包括腎),體長(zhǎng)≥10cm的大鯢則取肝、脾、腎。8病毒分離8.1樣品處理3應(yīng)在10℃以下進(jìn)行。先用組織研磨器將樣品勻漿，再用細(xì)胞培養(yǎng)液PBS緩沖液(A.1)按1:10的最終稀釋度組織懸液，加入100IU/ml雙抗(青霉素、鏈霉素A.2)后，置4℃冰箱作用1-2h后，反復(fù)凍融3次，用0.22μm的一次性濾器過(guò)濾除菌，濾液保存于-20℃或以下溫度冷凍保存。8.2細(xì)胞接種與觀察將上述濾液用細(xì)胞培養(yǎng)液(A.3)再做兩次10倍稀釋，然后將這1:10、1:100、1:1000三種稀釋度的濾液，分別接種到生長(zhǎng)24-48h的EPC單層細(xì)胞，按每2cm2的細(xì)胞單層接種100μL,的中，25°℃吸附1-2h后棄病毒液，然后加含2%FBS和100IU/ml雙抗的M199細(xì)胞培養(yǎng)維持營(yíng)養(yǎng)液(A.4),置于25℃培養(yǎng)。接種濾液后的細(xì)胞，7d內(nèi)每天用倒置顯微鏡觀察CPE出現(xiàn)情況。典型的CPE為細(xì)胞空泡、變圓、脫落。若細(xì)胞出現(xiàn)CPE,收集細(xì)胞液進(jìn)行鑒定。若細(xì)胞在接毒后7d未出現(xiàn)CPE,盲傳一次，再培養(yǎng)觀察7d,未出現(xiàn)CPE的樣品則判定為陰性。9病毒鑒定9.1樣品處理對(duì)有臨床癥狀的大鯢，按8.1的要求取樣勻漿后取50mg-100mg于1.5mlEP管中；對(duì)出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培的細(xì)胞培養(yǎng)物為陰性對(duì)照，用等體積的雙蒸水作為空白對(duì)照。DNA提取可使用商品化的組織病毒DNA抽提試劑盒(按說(shuō)明書(shū)操作),或使用傳統(tǒng)酚-氯仿提取法，具體操作如下(傳統(tǒng)法):a)將樣品置于-40℃冰箱反復(fù)凍融3次，12000r×5min;b)取上清400μl,加入500μltris-飽和酚，充分混合，靜置5min,12000r×5min,4℃;c)取上清加入飽和酚，氯仿各200μl,混勻，靜置5min,12000r×5min,4℃。重復(fù)一次；d)取上清加入200μl氯仿，混勻，12000r×5min,4℃,此時(shí)將出現(xiàn)分層。如果中層蛋白多，則重復(fù)上一步驟；e)取上清加1-2倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置20min,12000r×5min,4℃;f)棄上清，用75%酒精洗滌，12000r×5min,4℃,重復(fù)操作一次；g)棄上清，操作臺(tái)中自然晾干后，20-30μlTE溶解沉淀，-20℃保存，備用。9.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR管中加入12.5μlMix-reactionbuffer,上下游引物各lμl(10umol/L),DNA模板lμl,加入9.5μl無(wú)菌雙蒸水至25μl體積。設(shè)空白對(duì)照，空白對(duì)照取等體積的雙蒸水代替DNA模板?；靹蚝?，3000r/min離心30s。循環(huán)30次，最后72℃延伸1min,最后在72℃延伸10min,4℃保存。9.4瓊脂糖凝膠電泳用TAE電泳緩沖液(A.5)配制1%的瓊脂糖(A.6)平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液 (A.7)剛好淹沒(méi)膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液(A.8)混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。120V電泳約20-40min,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。于紫外光下觀察。4DB51/T2458—20189.5結(jié)果判定化與測(cè)序，若對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測(cè)序，并與已知序列(附錄B)比對(duì)，同源性達(dá)98%以上則為陽(yáng)性，a)細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)典型CPE,PCR檢測(cè)陽(yáng)性；d)細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)典型CPE,PCR檢測(cè)陽(yáng)性；5(規(guī)范性附錄)800mL超純水中溶解8gNaCl,0.2gKCl,3.58gNa?HPO?-12H?0,0.24gKH2P04,用1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為7.4,加超純水定容至1L,高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩⑶嗝顾睾玩溍顾孛顾赜贸兯涑筛鳛?0,000IU/mL濃度的混合儲(chǔ)存液，經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾后分裝，-20℃保存，使用時(shí)的工作濃度為100IU/mL。A.3M199營(yíng)養(yǎng)液按說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行配制，按說(shuō)明書(shū)加入一定量的NaHCOs調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH值為7.2,定容至1L,0.22μm濾器過(guò)濾除菌后分裝，4℃保存?zhèn)溆谩.4細(xì)胞生長(zhǎng)液(含10%胎牛血清的M199)、細(xì)胞維持液(含2%胎牛血清的M199)相應(yīng)加入胎牛血清即A.5TE緩沖液(pH8.0)將0.121gTris堿(分子量121.1),0.0372g乙二胺四乙酸二鈉(分子量372.24)加入80mL雙蒸水中，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,加雙蒸水定容至100mL,室溫保存。A.61%瓊脂糖凝膠瓊脂糖1g中加入1xTAE緩沖液100mL,加熱溶解后，加入5μLGoldenview混勻。A.750×TAE電泳緩沖液在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸